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【摘要】 目的 观察单次静脉滴注阿诺宁脂肪乳注射液对Beagle犬的急性毒性。方法 用近似致死剂量法（ALD）观察阿诺宁脂肪乳注射液对Beagle犬的急性毒性，观察其一般情况、心电图、血液学、血液生化、尿液检查。结果 犬单次静脉滴注阿诺宁脂肪乳注射液0.6～0.9 mg/（kg·w）时产生中重度中毒症状，主要表现为呼吸困难、低头、呕吐、安静少动、站立不稳、舌面苍白、口腔黏膜苍白或紫绀等症状，心电图及血液生化学出现多项指标改变，甚至死亡。结论 犬单次静脉滴注阿诺宁脂肪乳注射液的近似致死剂量范围为0.75～0.9 mg/（kg·w），安全剂量为0.4mg/（kg·w）。
【关键词】 阿诺宁脂肪乳 急性毒性；Beagle犬；ALD
Study on acute toxicity of squamocin injection
LI Yun-feng, ZHU Shao-xuan, YANG Wei, et al. The State Key Laboratory of Safety Evaluation on New Drugs in Guangzhou, Guangzhou Pharmaceutical Industrial Research Institute, Guangzhou 510240, China
【Abstract】 Objective To study on acute toxicity of squamocin injection in Beagle dogs.Methods The acute toxicity of squamocin injection was studied in 4 Beagle dogs with approximate lethal dose method (ALD). General status, ECG and parameters of hematology, blood biochemistry and urine were measured to evaluate the toxicity. Results Intravenous drip of squamocin injection at the dose of 0.6～0.9 mg/(kg·wt) showed moderate to severe toxicity in dogs: dyspnea, crouch, vomiting, quiet, stagger, tongue and mouth pale or cyanopathy etc, electrocardiogram and blood biochemistry appear many index changes, indeed death. Conclusion The range of approximate lethal dose is 0.75～0.9 mg/(kg·wt) with single intravenous drip of squamocin injection in Beagle dogs, dose of safety is 0.4 mg/(kg·wt).
【Key words】 squamocin injection; acute toxicity; Beagle dog; ALD
阿诺宁脂肪乳注射液是中国科学院华南植物研究所研制的新药，临床上主要用于治疗肿瘤等疾病。本实验对阿诺宁脂肪乳注射液进行了急性毒性研究，观察Beagle犬单次静脉滴注阿诺宁脂肪乳注射液后，对机体可能产生的毒性反应及死亡情况，了解阿诺宁脂肪乳注射液急性毒性强度，找出毒性反应的靶器官，为长期毒性、特殊毒性试验选择剂量提供依据，为临床毒副反应的监护提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂 阿诺宁脂肪乳注射液，乳白色液体，中国科学院华南植物研究所提供，批号020926，1.0mg/（ml·支），冷藏保存。使用时用生理盐水配制成相应浓度。
1.2 动物 普通级Beagle犬（9.5±0.5 kg），雌雄各2只，由广州市医药工业研究所实验动物研究室提供，动物质量合格证号为：粤监证字2004A041号。动物在实验前检疫观察2周。在此期间，观察动物的外观体征、行为活动、粪便性状及食欲等，进行血液生化及心电图等检查。
1.3 仪器 SWELAB AC920EO血球分析仪（瑞典）；日立7020自动血液生化分析仪（日本）；Easylyte plus K+/Na+/Cl-分析仪（美国）；BE Thromotimer凝血时间测定仪（德国）；CLINITEK-100尿液分析仪（德国）；ECG-9020K型心电图机（日本）；Leica ASP 300 全密封自动脱水机（德国）；病理图像分析系统包括OLYMPUS BX40显微镜和JVC TK-C1381 摄像仪（日本）等。
1.4 给药剂量及方法［1，2］ 根据小鼠急性毒性剂量［LD50为1.8 mg /（kg·w），本实验室急毒试验报告］和《中药、天然药物急性毒性试验技术指导原则》，采用近似致死剂量法，设剂量0.4、0.6、0.75、0.9mg/（kg·w）。每个剂量给1只动物，根据动物是否死亡来确定下一个剂量，采用等容量不同浓度，单次静脉滴注给药。
1.5 观察指标
1.5.1 一般情况 观察犬的外观、行为活动、步态、精神、饮食、体重、大便、呼吸、瞳孔、皮毛、有无流涎、恶心、呕吐等，注射部位有无出血、水肿、感染等。如有动物死亡，则记录时间及死亡数，并及时解剖了解死因。
1.5.2 心电图 犬以站立姿势固定于狗兜上，用心电图机测II导联心电图，观察心率、P波电压、P-R间期、R波电压、QRS时间、ST段、T波电压及Q-T间期共8项指标的变化。
1.5.3 血液学 每只犬取静脉淤血，以EDTA抗凝，用SWELAB AC920EO自动血球分析仪测定以下指标：红细胞（RBC）、红细胞压积（HCT）、红细胞平均体积（MCV）、血红蛋白(Hb)、红细胞分布宽度（RDW）、红细胞平均血红蛋白含量（MCH）、红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）、血小板、白细胞总数（WBC）等。
1.5.4 血液生化 静脉取血，3000rpm离心20 min，取血清，用日立7020自动血液生化分析仪测定以下指标：天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)、血糖(GLU)、总胆固醇(T-CHO)、总胆红素(TBiL)、肌酸激酶（CK）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）、乳酸脱氢酶（LDH）、血清磷（IP）、血清钙（Ca）、甘油三酯（TG）、胆碱酯酶（CHE）等。用Easylyte plus K+/Na+/Cl-分析仪测定K+、Na+、Cl-。
1.5.5 尿液分析 收集12h尿液，用CLINITEK-100尿液分析仪测定尿液葡萄糖、胆红素、酮体、比重、pH、尿胆原、尿蛋白、亚硝酸盐、红细胞、白细胞等10项指标。
1.5.6 病理和组织学检查 对死亡之动物先做大体解剖检查，其他动物在观察期结束后进行大体解剖。尸检异常的组织器官做组织病理学检查。
2 结果
2.1 一般情况 （1）♂4号犬在给予阿诺宁脂肪乳注射液0.9 mg/（kg·w）后，出现口腔黏膜及舌面苍白、站立不稳、呼吸困难、低头，15min后出现大小便失禁及腹式呼吸，25min后死亡。（2）♀3号犬在给予阿诺宁脂肪乳注射液0.75 mg/(kg·w）5min后出现心跳和呼吸减慢、口腔黏膜紫绀，15min后出现呕吐、低头、安静少动等症状，2h后恢复正常。（3）♂2号犬给予阿诺宁脂肪乳注射液［0.6 mg/（kg·w）］5min后出现心跳加快、呼吸急促等症状，20min后恢复正常。（4）♀1号犬给予阿诺宁脂肪乳注射液［0.4 mg/（kg·w）］后，未见明显异常。连续观察2周后，与给药前相比较，♀1号和♂2号犬的体重增长正常，♀3号犬的体重未见明显增长（见表1）。表1 阿诺宁脂肪乳对Beagle犬体重的影响
2.2 心电图 ECG之T波变化见表2，4号犬0.9 mg/（kg·w）因动物死亡未获得数据。与给药前相比，3号犬0.75 mg/（kg·w）T波电压升高，d7 ECG的T波电压恢复正常。其余动物与给药前相比，其心率、P波电压、P-R间期、R波电压、QRS时间、ST段、T波电压及Q-T间期均无明显变化。
2.3 血液学 4号犬因动物死亡而未能获取给药后的数据。与给药前相比，其他动物的RBC、HCT、MCV、Hb、RDW、MCH、MCHC等指标均无明显变化。
2.4 血液生化 生化指标变化见表2。4号犬因动物死亡而未能获取给药后的数据。与给药前相比，1、2、3号犬的ALT、AST、CK、LDH、TG均在给药后的1h、4h显著升高而在给药后的d7恢复正常。其余血液生化指标BUN、Crea、TCHO、Glu、TP、CHE等均在正常范围内波动。
2.5 尿液检查 每只动物d0、d1、d7的尿液葡萄糖、蛋白质、胆红素、尿胆原、pH值、比重、红细胞、酮体、亚硝酸盐及白细胞在给药前后无明显变化。
2.6 病理及组织学检查 4号犬死亡后进行了病理学检查。表2 阿诺宁脂肪乳注射液对Beagle犬部分ECG及血液生化指标的影响注：t1、t4分别表示给药后1、4h；“-”表示未测到。
3 讨论
近似致死剂量法（approximate lethal dose, ALD）主要用于非啮齿类动物的急性毒性试验。具体方法如下：一般选用6只成年健康犬或猴，一般为7～8个月龄，选用其他种属的动物应说明理由；根据小动物的毒性实验结果、受试物的化学结构和其他相关资料，估计可能引起毒性和死亡的剂量范围；按50%递增法，设计出含数个剂量的序列表；根据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂量，在此范围内，每间隔1个剂量给1只动物，测出最低致死剂量和最高非致死剂量，然后用两者之间的剂量给1只动物，此剂量即为所要求的近似致死剂量［3］。
阿诺宁脂肪乳注射液临床静脉滴注用量为0.2 mg/（人·d），犬给药时与临床拟用途径一致。小鼠急性毒性实验测得静脉注射的LD50为1.8 mg/（kg·w），大鼠长期毒性实验表明给予0.4 mg/（kg·w）阿诺宁脂肪乳注射液出现肝肾毒性（本实验室大鼠长期毒性试验报告）。本研究结合了小鼠急性毒性、大鼠长期毒性结果及犬急毒预实验结果，设计剂量范围为0.4～0.9mg/（kg·w），实验结果表明剂量的设置是恰当的。阿诺宁脂肪乳注射液单次静脉滴注对Beagle犬的近似致死剂量范围为0.75～0.9mg/（kg·w），主要的毒性反应表现为呼吸困难、低头、呕吐、安静少动、站立不稳、舌面苍白、口腔黏膜苍白或紫绀等症状，心电图及血液生化学出现多项指标改变等，甚至死亡。根据临床症状和体征，结合血液生化及ECG等检测，找到了中毒靶器官主要肝肾，且毒性作用均是可逆的。观察到了阿诺宁脂肪乳注射液对Beagle犬的无毒剂量为0.4 mg/（kg·w），相当于临床拟用量的120倍。
【参考文献】
1 袁伯俊，王治乔．新药临床前安全性评价与实践．北京：军事医学科学出版社，1997，196-199.
2 中药、天然药物急性毒性试验技术指导原则课题研究组．中药、天然药物急性毒性试验技术指导原则，2005,3.
3 化学药物急性毒性试验技术指导原则课题研究组．化学药物急性毒性试验技术指导原则,2005,3.
(编辑：石 岚)
作者单位：基金项目：广州市科技项目“《消癌净》临床前研究（一）”资助项目（编号：98-Z-036-01） 510240 广东广州，广州市医药工业研究所（△通讯作者）