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【摘要】 目的 建立实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应（real-time quantitative, RT-PCR）检测膀胱移行细胞癌（BTCC）组织VEGF mRNA表达的方法,并验证其与免疫组织化学检测VEGF蛋白表达的相关性。方法 采用免疫组织化学SP法和实时荧光定量RT-PCR法分别从蛋白水平和mRNA水平检测了31例BTCC和15例正常膀胱黏膜组织中VEGF的表达。结果 BTCC中VEGF mRNA表达水平显著高于正常组，两组比较差异有显著性（P<0.05）;BTCC中表达水平在高分化组与中低分化组之间、Tis-T1期与T2-T4期间的差异均有显著性（P<0.05）。VEGF的阳性表达率在BTCC组中为100%,显著高于正常组（P<0.05），在高分化组与中低分化组之间、Tis-T1期与T2-T4期间的差异均有显著性（P<0.05）。结论 本研究所建立的用于检测人BTCC组织VEGF mRNA表达的实时荧光定量RT-PCR方法,是一种快速有效、灵敏度高、特异性好的定量检测方法,与免疫组化SP方法检测的VEGF蛋白表达具有良好相关性，可作为研究膀胱肿瘤的生物学行为和判断预后的参考指标。
【关键词】 膀胱癌;血管内皮生长因子;免疫组织化学；实时荧光定量RT-PCR
Detection of VEGF mRNA in bladder transitional cell carcinoma by real-time fluorescence quantitative RT-PCR
AN Quan-yi, ZHANG Jin-gang, LIU De-bin,et al.The Police Group of Dalate Qi, Neimenggu 014300，China
【Abstract】 Objective To establish a real-time fluorescence quantitative RT-PCR for detection of VEGF mRNA expression in bladder transitional cell carcinoma （BTCC） and verify the correlation with protein expression detected by the immunohisochemistry method.Methods Total RNA was extracted with Trizol from the tissues and mRNA was transcribed reversely into cDNA. The real-time quan-titative RT-PCR was used to detect the expression of VEGF mRNA in 31 in BTCC and 15 control normal bladder mucosa tissues. The immunohistochemistry SP method was used to evaluate the protein expression of VEGF.Results The expression of VEGF mRNA was significantly higher in BTCC tissues than that in the normal bladder mucosa tissue tissues （P<0.05）. BTCC expression levels in well-differentiated group and between groups of poorly differentiated, Tis-T1 with T2-T4 period differences were statistically significant （P<0.05）.Conclusion Real-time fluorescence quantitative RT-PCR used to detect the expression of VEGF mRNA might be a reliable method for early diagnosis of BTCC. The expression of VEGF mRNA is correlated with that of the VEGF protein significantly. It can be used to study the biological behavior of bladder cancer and judg the prognosis.
【Key words】 bladder cancer;vascular endothelial growth factor;immunohistochemistry;real-time fluorescence quantitative RT-PCR
膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其中膀胱移行细胞癌（bladder transi-tional cell carcinoma,BTCC）占90%以上,且复发率极高，复发后肿瘤恶性度可增高、浸润、转移等行为有增强趋势。此过程与肿瘤细胞外基质的降解、新生血管的大量形成有密切关系。血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，能促使肿瘤的血管生成、血管内物质外渗、为肿瘤细胞血管生长和迁移提供基质。在肿瘤发生发展过程中起重要作用。血管内皮生长因子（VEGF）是调节肿瘤血管生成的重要因子,具有促进血管内皮细胞有丝分裂,增强血管通透性,促进内皮细胞增殖并延缓其凋亡等多重功能［1］。近来研究者在多种恶性肿瘤组织中检测到VEGF的高表达,并推测其与肿瘤生长和转移密切相关［2，3］;与BTCC血管生成相关的多种促血管生成因子中,组织VEGF表达含量最高,可能与BTCC浸润和转移密切相关,可作为预后判断的重要指标之一。但以往检测组织中VEGF的表达主要采用免疫组化和常规PCR技术,国内尚未见采用实时荧光定量PCR检测BTCC组织VEGF mRNA表达的报道,国外亦极少见报道。本研究拟建立实时荧光定量RT-PCR测定BTCC组织VEGF mRNA表达的方法,并验证其与免疫组织化学SP方法检测VEGF蛋白表达的相关性。并结合BTCC的病理分级和临床分期,探讨了VEGF在BTCC发生发展中作用，以期为BTCC准确的临床诊断、治疗和评价预后提供依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 BTCC样本选自伊盟医院泌尿外科15例和内蒙古自治区医院16例，其中男21例,女10例,平均60.91岁。所有标本均经病理检查证实。所有患者术前均未行药物化疗、放射治疗、免疫或生物治疗。按WHO标准病理分级:G1,G2,G3。临床分期按分期采UICC-TNM标准:浅表性 （Tis-T1）,浸润性 （T2-T4）。另取15例正常膀胱黏膜作为对照。全部标本平均分成两份，一份经4%中性甲醛溶液固定,石蜡包埋、切片,并行HE和免疫组织化学染色。另一份经生理盐水清洗后投入液氮罐中，移入-70℃低温冰箱贮存备用。
1.2 免疫组化法
1.2.1 具体操作 按即用型S-P试剂盒说明书进行。一抗分别为鼠抗人VEGF多克隆抗体,每次实验均设阳性及阴性对照, VEGF阳性对照为已知胃癌的免疫组化染色阳性片,阴性对照为PBS液替代一抗。
1.2.2 结果判定标准 高倍显微镜（×400）下观察5个视野,每个视野计数100个细胞,以阳性细胞百分率和染色强度为判定标准［4,5］。胞质无染色为阴性（-）;阳性细胞数<20%为弱阳性（+）;阳性细胞数20%～60%为中度阳性（++ ）;阳性细胞数>60%为强阳性（+++）。
1.3 实时荧光定量RT-PCR法
1.3.1 试剂和仪器 试剂: Trizol试剂（Gibco公司,美国）,逆转录酶M-MLV （Promega公司）, Taq酶（Sangon公司）, DEPC （Sigma公司），引物 荧光探针合成和PCR反应试剂盒（上海生工公司）: VEGF上游引物序列为5’-ATGAACTTTCTGCTGTCTTGG-3’,下游引物序列为5’-TCACCG CCTCGGCTTGTCACA-3’;β-actin上游引物序列为5’-GATTGGAATCTGGCTACT-3’,下游引物序列为5’-TAGGGCTGAAGACAGGG-3’; 仪器：实时定量PCR仪（美国MJ OPTICON-2）。
1.3.2 RNA提取和反转录 按照大连宝生物工程有限公司Trizol总RNA提取试剂说明提取RNA。用紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检提取到的RNA的完整性、纯度和含量。剩余RNA于-70℃保存备用。反转录前直接将6.5μl的RNA加入到反转录体系中合成cDNA。反应体系为10μl，其中PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μl（TaKaRa DRR037S）、5×PrimeScript Buffer 2μl、Random 6mers（引物）0.5μl、Oligo dT Primer（引物）0.5μl。于PCR仪进行反转录，反应条件为：37℃15min，85℃ 5s。
1.3.3 实时定量PCR 采用SYBR Green I荧光染料法进行实时定量PCR扩增的检测。PCR反应体系为20μl，其中2×SYBRpremixEXTaq TM10μl（TaKaRa DRR041A）、上下游引物各0.4μl（10μmol/L）、cDNA 2μl、dH2O 7.2μl。于实时定量PCR仪（美国MJ OPTICON-2）分别进行VEGF和β-actin的PCR反应，扩增条件为：95℃预变性30s；95℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸10s，45个循环后，72℃延伸10min。反应过程中同时设阳性对照，以水替代cDNA为阴性对照。VEGF mRNA相对表达量采用2-ΔCT进行计算,ΔCT=CTVEGF-CTβ-actin。
1.3.4 PCR扩增产物特异性的确定 PCR产物经单一熔解曲线峰进行确定，并取5μl PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳（100V，15min）确定扩增产物片段大小后，送交上海生工进行序列测定。
1.4 统计学分析 应用SPSS 11.0统计软件采用χ2检验及相关性分析,P<0.05为差异有显著性统计免疫组化结果；采用进行单因子方差分析P<0.05为差异有显著性统计荧光定量PCR结果。
2 结果
2.1 免疫组化结果
2.1.1 BTCC组与正常对照组的关系 VEGF的阳性染色主要位于癌细胞胞浆内,呈弥散性分布,部分间质细胞也有表达（见图1～3）。在正常膀胱黏膜细胞中均不表达或低表达,而在BTCC中阳性表达率分别为100%。两组比较差异有显著性（P<0.05）（如图1～3，表1）。表1 BTCC组与正常对照组VEGF的表达 注：BTCC组与正常对照组比较差异有显著性（P<0.05）
2.1.2 VEGF表达与病理分级、临床分期的关系 VEGF分别在BTCC的病理分级和临床分期中表达的差异均有显著性（P<0.05,见表2）。表2 VEGF在BTCC病理分级及临床分期中的阳性表达注：G2、G3与G1比较有统计学意义（P<0.05）, T2-T4与Tis-T1比较有统计学意义（P<0.05）
2.2 实时荧光定量PCR结果 实时定量PCR检测BTCC组和正常对照组VEGF的mRNA的变化（见图4）。
3 讨论
VEGF是一种由肿瘤细胞分泌的二聚体多肽,相对分子量为34～45KD,基因定位于6P21.3,有5种分子变异体［6］。一些直接、间接的证据已经证明肿瘤生长是血管依赖的［7］。与大多数实体的恶性肿瘤一样, BTCC的发生发展依赖血管生成［8］。肿瘤进展过程中肿瘤组织可分泌多种因子和多种蛋白水解酶类,特别是VEGF转移到内皮细胞和血管基底膜表面,以促进内皮细胞分裂,增加毛细血管的通透性,利于内皮细胞的增殖和迁移,促进肿瘤新生血管的形成。同时VEGF还能促进内皮细胞和恶性肿瘤细胞表达整合素,以利用肿瘤细胞的迁移、黏附和浸润［9］。BTCC的分级越高,细胞的分化水平就越低,细胞的生长就越活跃,这可能是在肿瘤组织和患者的血液研究中,都得出随着肿瘤的病理学分级的升高,组织和血液中的VEGF含量都逐步升高的原因,浸润性肿瘤的细胞生长当然比浅表性肿瘤的细胞生长要活跃,可见,浸润性肿瘤的细胞VEGF的含量当然要比浅表性肿瘤细胞VEGF的含量高。免疫组化研究发现正常组织中87%无VEGF阳性表达,而31例BTCC组织中VEGF阳性表达为100%，且随着病理级别的增高,VEGF阳性信号明显加强,进一步表明了VEGF蛋白在BTCC中的表达与BTCC细胞的分化程度有关系,在浸润癌中VEGF的阳性信号明显高于浅表癌,提示VEGF表达与膀胱癌细胞的浸润能力有关。
实时RT-PCR是一种能精确测定基因mRNA表达水平的荧光检测系统,在每一个RT-PCR循环的延伸阶段,基因产物都有一次定量检测,这种新方法和传统RT-PCR相比有很多优点。本研究采用实时RT-PCR定量方法进行BTCC组织VEGF mRNA定量分析,结果显示, BTCC组织中VEGF mRNA表达水平明显高于正常组织（P<0.05）。VEGF转录水平升高,提示肿瘤细胞可能合成或分泌更多的VEGF蛋白,但由于基因转录翻译过程会受到多种因素的影响,基因转录水平和组织蛋白水平可能会出现不一致性,既往有研究者的实验曾得出阴性结论,分析发现这些研究者多采用人为染色强度等级判断的方法进行蛋白水平比较分析,难以区分染色程度接近切片之间的表达强弱,而彩色病理分析系统从一定程度上解决了这个问题,增强了敏感性。本实验采用该方法进行半定量分析结果显示, VEGF蛋白表达水平在BTCC组和正常对照组中的分布特点与VEGF mRNA表达完全一致,并呈正相关关系,提示VEGF与BTCC的发生和生长密切相关系。综上所述,本研究建立的用于检测人BTCC的VEGF mRNA的表达的实时荧光定量RT-PCR方法,是一种快速有效、灵敏度高、特异性好的定量检测方法,与免疫组化SP方法检测的VEGF蛋白表达具有良好相关性, VEGF与BTCC病理分期、分级和肿瘤增殖能力的生物学行为有密切的关系，在BTCC的早期诊断和良恶性鉴别诊断中具有重要的参考价值。（本文彩图见封三）
【参考文献】
1 Claffey KP, Wilkison WO，Spiegelman BM.Vascular endothelial growth factor. Regula-tion by cell differentiation and activated sec-ond messenger pathways. J Biol Chemi,1992, 267 （23）: 16317-16322.
2 Zhang L, Hannay JA, Liu J, et al. Vas-cular endothelial growth factor overexpression by soft tissue sarcoma cells: implications for tumor growth, metastasis, and chemoresis-tance. Cancer Res, 2006, 66 （17）:8770-8774.
3 Karpanen T, Egeblad M, Karkkainen MJ,et al. Vascular endothelial growth factor Cpromotes tumor lymphangiogenesis and intra-lymphatic tumor growth. Cancer Res，2001, 61 （5）: 1786-1790.
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7 Thaloor D,Singh AK，Sidhu GS,et al.Inhibition of angiogenic differentiation of human umbilical vein endothelial cells by curcumin.Cell Growth Differ,1998,9（4）:305-312.
8 Campbell SC,Volpert OV,Ivanovich M,et al.Molecular mediators of angiogenesis in bladder cancer.Cancer Ras,1998,58（6）:1298-1304.
9 李文平.血管内皮生长因子在膀胱肿瘤中的检测意义.河北医药,2002,24（11）:867-868.
作者单位：1 014300 内蒙古鄂尔多斯，鄂尔多斯市达拉特旗公安局刑警大队2 017000 内蒙古鄂尔多斯，鄂尔多斯市东胜区公安局刑警大队3 010011 内蒙古呼和浩特，内蒙古自治区人民检察院技术处4 100112 内蒙古呼和浩特，内蒙古武警总队医院5 010015 内蒙古呼和浩特，内蒙古自治区医院6 010059 内蒙古呼和浩特，内蒙古医学院基础医学院（通讯作者）