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The correlative study on936C/T gene polymorphism of vascular endothelial growth factor（VEGF）associated with breast cancer
Lu Xu，Li Bo，Wei Junmin，et al.
Department of General Surgery，Beijing Hospital，Beijing100730.
【Abstract】 Objective To investigate the association between936C/T gene polymorphism of vascular en-dothelial growth factor and breast cancer risk.Methods Using the method of restricitive fragment length polymor-phism，the VEGF genotypes of138female breast cancer patients and140healthy control subjects that age and sex matched were detected.The association between VEGF936C/T gene polymorphism and cancer characteristics was compared.Results The frequency of VEGF936T-allele was0.164in healthy Han Chinese.The frequency of carri-ers with936T-allele（936CT-936TT）in breast cancer patients was16.8%，significantly lower than that in controls with30.7%，P=0.006.The odds ratio of carriers with936T-allele in patients was0.451，95%confidence interval was0.254～0.801.The same inclination was showed in936C/T allele frequency:the936C allele frequency of pa-tients（90.9%）was higher than that of controls（83.6%），while the936T allele was much less frequent among pa-tients（9.1%）than that among controls（16.4%）.No associations were investigated between VEGF936C/T gene polymorphism and breast cancer characteristics，such as the tumor size，lymph node metastases，estrogen receptor and progesterone receptor.Conclusion VEGF936C/T gene polymorphism was associated with breast cancer.The carriers with936T-allele could decrease the risk of breast cancer.This polymorphism site was not associated with the tumor pathologic characteristic.
【Key words】 vascular endothelial growth factor（VEGF） breast cancer gene polymorphism
肿瘤的生长、侵袭及转移都依赖血管生成 ［1］ 。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管生成的最重要的调节因子 ［2，3］ 。有文献报道，VEGF的3′-UTR区的936C/T基因多态性与血浆VEGF水平及乳腺癌的危险性相关 ［4］ 。目前还未见有关中国人群的VEGF936C/T基因多态性与乳腺癌关系的报道。我们对中国汉族人群中的这个多态性位点与乳腺癌的关系进行初步研究。
1 资料与方法
1.1 研究对象 选取我院2003年1月～12月，经病理确诊的乳腺癌女性患者138例，排除其它合并肿瘤和疾病，年龄在32～86岁之间，平均为53.6岁。同时选取与病例组的性别和年龄相匹配的健康对照人群140例。所有研究对象均为汉族。
1.2 VEGF基因型的鉴定 抽取空腹静脉血5ml，按常规方法从白细胞中提取基因组DNA，存4℃保存。PCR引物序列如下:正向引物:5′-AAGGAAGAGGAGACTCTGCGC-3′，反向引物:5′-TATGTGGGTGGGTGTGTCTACAG-3′。PCR反应体系按常规。温控条件:95℃预变性4min;95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环后，72℃再延伸5min。用2%琼脂糖电泳鉴定PCR产物，为198bp。PCR产物用内切酶NIaIII（New England Biolabs）5U于37℃消化3h后，再经3%琼脂糖电泳鉴定VEGF基因型。
1.3 统计学方法 应用Windows SPSS10.0对数据进行统计学分析。Hardy-Weinberg平衡和计数资料用χ 2 检验;比值比（odds ratio，OR）用来衡量乳腺癌的危险性。P<0.05为有差异。
2 结果
2.1 VEGF基因型的判断 含有936C等位基因的片段没有NIaIII的酶切位点，不能被切开，仍为198bp;而含有936T等位基因的片段含有NIaIII的酶切位点，被酶解成114bp和84bp两个小片段。因此，经NIaIII酶切后，936CC纯合子为198bp一个片段;936CT杂合子为198bp、114bp和84bp三个片段;936TT纯合子为114bp和84bp两个片段。
2.2 病例组与对照组的VEGF936C/T基因型和基因频率分布 见表1。病例组和对照组的基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，χ 2 分别为0.407和0.199，P>0.05。正常中国汉族人群的VEGF936T等位基因频率为0.164。
2.3 结果显示 病例组的936CC型占83.3%，高于对照组中的69.3%;而病例组的936CT+936TT型为16.8%，显著低于对照组的30.7%，P=0.006。等位基因频率也显示出了相同的倾向:病例组的936C（90.9%）高于对照组（83.6%）;而936T等位基因的频率在病例组中（9.1%）则明显低于对照组（16.4%）。病例组的936T等位基因携带者的比值比（odds ratio，OR）为0.451，95%可信区间（confidence in-terval，CI）为0.254～0.801。说明936T具有降低乳腺癌危险的作用。
2.4 对VEGF基因型与乳腺癌病理状况的可能相关性的研究 见表2。根据肿瘤的病理结果，如肿块大小（>2cm/≤2cm）、淋巴结转移（+/-）、雌激素受体（-/+）及孕激素受体（-/+）等影响预后的因素，将病例组和对照组分别分成四组，分析它们与VEGF基因型的关系。结果表明:VEGF的936C/T基因多态性与这4种因素均没有相关性。
表1 病例组与对照组的VEGF936C/T基因型和基因频率分布（略）注: * P<0.05，差异有显著性
表2 VEGF936C/T基因多态性与乳腺癌病理状况的相关性分析 n（略）注: * P>0.05，差异无显著性
3 讨论
乳腺癌是危害女性健康的最常见恶性肿瘤之一，发病率约为女性全身肿瘤的1/3，最近几年其发病率和死亡率都有增加趋势。乳腺癌的病因仍然没有完全阐明。环境/遗传、多基因、多态性这三个方面是乳腺癌研究的热点。应用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）进行遗传性相关性研究，可以为罹患乳腺癌的危险性提供预示作用。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种二聚糖，在一些肿瘤组织中过表达。血浆VEGF水平对肿瘤的生长和患者的存活率具有很高的预示 性，阻断VEGF的作用可以抑制肿瘤的生长 ［5］ 。在正常人中，VEGF的936C/T多态性与血浆低VEGF水平显著相关 ［4，6］ 。VEGF的936C/T多态性影响VEGF水平的机制目前还不明了。936C有一个潜在的AP-4（activa-tor protein4）结合位点，而936T则没有。AP-4是一种转录因子，通过结合到增强子的特异位点上，可增强一些基因的转录。936T缺失了这个潜在的AP-4结合位点，可能与其VEGF表达降低有关 ［6］ 。乳腺癌是一种多基因病，目前国内对乳腺癌基因多态性分析的报道不多，还未见有关VEGF936C/T多态性的研究。我们对本院2003年收治的138例乳腺癌患者进行了VEGF936C/T多态性与疾病的相关分析。结果表明，乳腺癌患者中的VEGF936T等位基因携带者比例（16.8%）明显低于正常人群中的比例（30.7%），P=0.006;病例组的936T等位基因携带者的OR值为0.451，95%CI为0.254～0.801，这都说明936T具有降低乳腺癌危险的作用，提示VEGF936T等位基因可能是乳腺癌的保护因子。我们所检测到的正常中国汉族人群的VEGF936T等位基因频率为0.164，与文献报道的欧洲高加索人群（0.16） ［4，6］ 和日本人群（0.14） ［7］ 的结果相近。对VEGF基因型与肿块性质的相关性的研究表明:VEGF的936C/T基因多态性与肿块大小、淋巴结转移、雌激素受体及孕激素受体均没有相关性。这也与欧洲的研究结果相同 ［4］ 。我们的研究结果证实:在中国汉族人群中，VEGF936T等位基因可能是乳腺癌的保护因子，对VEGF基因型与乳腺癌病理状况的研究没有发现相关性。不过，一方面，影响乳腺癌的因素很多，另一方面，我们研究的样品数有限，因此，VEGF的936C/T基因多态性与乳腺癌的关系还有待于来自更多样本研究的证实。来自欧洲和我们的研究都支持VEGF936T等位基因可能是乳腺癌的保护因子，如果能得到更多实验室的研究证实，如果进一步的研究能揭示这个位点与其他恶性肿瘤的相关性，那么VEGF的936C/T可能有抗血管生成的药物研究价值。
参考文献
1 Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis depen-dent?J Natl Cancer Inst，1990，82:4-6.
2 Gerber HP，Hillan KJ，Ryan AM，et al..VEGF is required for growth and survival in neonatal mice.Development，1999，126:1149-1159.
3 Leung DW，Cachinaes G，Kuang WJ，et al.Vascular endothelial growth factor is secreted angiogenic mitogen.Science，1989，246:1306-1309.
4 Krippl P，Langsenlehner U，Renner W，et al.A common936C/T gene polymorphism of vascular endothelial growth factor（VEGF）is associated with decreased breast cancer risk.Int J Cancer，2003，106:468-471.
5 Carmiliet P，Jain PK.Angiogenesis in cancer and other diseases.Nature，2000，407-257.
6 Renner W，Koschan S，Hoffmann C，et al.A common936C/T mutation in the gene of vascular endothelial growth factor is associated with vas-cular endothelial growth factor plasma levels.J Vasc Res，2000，37:443 -448.
7 Awata T，Inoue K，Kurihara S，et al.A common polymorphism in the5′-untranslated region of the VEGF is associated with diabetic retinopa-thy in type2diatetes.Diabetes，2002，51:1635-1639.
作者单位:100730北京医院普外科