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Study on the expression of human insulin gene in houselfy
Li Hua，Liu Weiquan，Wang Benxu，et al.
Faculty of Laboratory Animal，Chinese Medical University，Shenyang110001.
【Abstract】 Objective Study on the effect of the expression product of human insulin gene in housefly.Methods The KMwere divided into four groups randomly.Transgenic expression products of insulin in housefly magˉgot were then injected into KM mice intraperitoneally.And variation of the concentration of blood sugar was detercted at the time24h before injection，6h and72h postinjection.Results The statistical analyisis results showed that the aglycemia was found in all groups including transgenic houselfly，recombinant baculovirus infected housefly and normal housefly at the time of6h postinjection.And the degree of change in the former two groups was more significantly than normal group of houselfly.Conclusion The expression products of human insulin gene in houselfy have the effect of reducing blood sugar level of KM mice.It is the first time to be discovered that the homogenization of mormal housefly has the effect of reducing blood sugar of mice.
Key words human insulin expression products housefly KM mice blood sugar
由于胰岛素在临床上的重要性和巨大的市场需求，极大地吸引着人们通过DNA重组技术生产胰岛素。因此，有关基因工程胰岛素的报道很多 ［1～4］ 。但尚未见到利用家蝇作为生物反应器表达人胰岛素的报道。本研究就是在已有的实验基础上，利用家蝇作为生物反应器，将经转基因和杆状病毒表达系统在家蝇中表达的人胰岛素产物，粗步纯化后对正常小鼠进行腹腔注射，以分析人胰岛素基因在家蝇中表达产物对昆明小鼠血糖的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康成年昆明小鼠随机分成8组，每组10只，雌雄各半。均在相同的条件下饲养。自由饮水，自由采食人工颗粒料，每日光照14h。分组情况见表1。
1.2 表达质粒pEE1α-ImINS 见参考文献 ［5］ 。
1.3 转基因家蝇 见参考文献 ［6］ 。
1.4 重组杆状病毒感染家蝇的幼虫 见参考文献 ［7］ 。 表1 生物学效应试验的分组表分组 注射样品小鼠（略） 注射剂量Ⅰ PBS 10 0.5ml/只Ⅱ 正常家蝇72h蝇蛆匀浆 10 50mg/只ⅢE/I转基因家蝇F2代72h蝇蛆匀浆10 50mg/只Ⅳ 杆状病毒感染蝇蛆后72h的匀浆 10 50mg/只
1.5 放射免疫测定（RIA）法测定胰岛素和（或）胰岛素原的表达量 分别收集转基因并经G418筛选的F 2 代96h蝇蛆、重组杆状病毒感染家蝇幼虫后96h蝇蛆和正常家蝇96h蝇蛆20只，用PBS（pH7.2）洗涤，去体表水，称量，按100mg/ml加PBS（pH7.2），制成匀浆，取100μl进行放免测定胰岛素的表达量，每组同时测2个样品，取平均值。
1.6 注射用家蝇蝇蛆匀浆 分别取转基因并经G418筛选的F 2 代96h蝇蛆、重组杆状病毒感染家蝇幼虫后96h蝇蛆和正常家蝇96h蝇蛆，制成100mg/ml匀浆，10000r/min离心20min，取上清，再用10kDa Miliiporo超滤器粗步纯化，立即腹腔注射小鼠，每只注射0.5ml，对照组生只注射0.5ml PBS。1.7 血糖测定 在注射前24h、注射后6h、72h，剪尾取血，分离血清，用葡萄糖氧化酶法测定血糖 ［8］ 。
2 结果
2.1 放射免疫测定（RIA）法测定胰岛素和（或）胰岛素原的表达量 经放免测定，重组质粒pEE1α-ImINS转家蝇后，经G418筛选，F 2 代96h蝇蛆中胰岛素和（或）胰岛素原的表达量为43.348μIU/ml。重组杆状病毒感染家蝇幼虫后，其96h的蝇蛆中胰岛素和（或）胰岛素原的表达量为37.401μIU/ml，详见表2。
2.2 小鼠血糖的测定和分析结果 对注射前24h、注射后 6h和注射后72h小鼠进行血糖测定，并用配对t检验进行 统计学分析，结果Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组注射后与注射前比较，差异均有显著性。甚至在第Ⅲ组中有3只小鼠因血糖过低而致死。见表3、4。 表2 在家蝇中胰岛素表达产物放免测定结果 表4 蝇蛆中表达产物对小鼠血糖的影响 （略）图1 注射家蝇表达产物前后小鼠血糖的变化曲线图2 注射转基因家蝇表达产物后6h和7h的组间比较 注:Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组比较， ☆☆ P<0.01;Ⅲ组与Ⅱ、Ⅳ组比较， ★ P<0.05;Ⅲ组与Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ组比较， ◆ P<0.05
3 讨论
自1921年Banting和Best首次从胰腺分离出胰岛素，并用于治疗糖尿病以来，胰岛素用于临床已有70多年的历史 ［9］ 。由于胰岛素是治疗糖尿病的特效药物，而糖尿病患者在人口中的比例呈逐年增加的趋势，所以对胰岛素的需求量也在增大。这是促使人们不断改进老工艺和采用新的科技成果生产胰岛素的动力。DNA重组技术的出现为胰岛素的生产开创了新途径。近年有关基因工程胰岛素的报道很多，但未见到利用家蝇作为生物反应器和利用杆状病毒表达系统表达人胰岛素的报道。本研究在已有的实验基础上，选用了在转基因家蝇中表达量最高的（用pEF1- ImINS电转移的）转基因家蝇96h蝇蛆匀浆和利用杆状病毒 表达系统在家蝇中表达了人胰岛素的96h蝇蛆匀浆，经粗步纯化后，对正常小鼠进行腹腔注射，分析了转基因所获得的表达产物对小鼠血糖的影响情况。从统计分析的结果可以得出，转基因家蝇组、杆状病毒感染家蝇组和正常家蝇组在注射前后，血糖都有明显的变化，并且转基因家蝇组和杆状病毒感染组注射后6h与注射前24h比，其血糖降低的幅度比正常家蝇组还大，其中转基因家蝇组中有3只小鼠在注射后24h因血糖过低而死亡。这说明:转基因家蝇中人胰岛素的表达产物对正常小鼠具有明显的降血糖生物学效应;杆状病毒感染家蝇幼虫后，其96h蝇蛆中的人胰岛素表达产物对正常小鼠具有降血糖的生物学效应。另一方面，通过本实验首次发现正常家蝇蝇蛆的PBS匀浆对正常昆明小鼠也具有降血糖作用。所以，转基因家蝇表达产物所表现的明显降血糖作用，可能是外源基因所表达的胰岛素和家蝇本身胰岛素或胰岛素样类似物累加效应所致。
参考文献
1 冯佑民，张友尚.重组人胰岛素研究的回顾和展望.生物工程进展，1996，16（4）:26-31.
2 陈燕，李金照，夏令朝，等.人胰岛素原基因在大肠杆菌中高效外分泌表达.生物化学杂志，1995，11（6）:637-641.
3 Stepien PP，Brousseau R，Wu R，et al.Synthesis of a human insulin geneⅣExpression of the synthetic proinsulin in yeast.Gene，1983，24（2-3）:289-297.
4 申同建，张继仁，于耀德，等.人胰岛素原基因在酵母中的分泌表达.生物化学杂志，1987，3（2）:153-158.
5 李华，王苹，刘维权，等.人胰岛素基因在幼仓鼠肾细胞中的表达及其降血糖实验研究.中国医科大学学报，2004，33（1）:18.
6 李华，刘维权，刘海鹏，等.在家蝇中表达人胰岛素的研究.中国比较医学杂志，2003，13（6）:321.
7 李华，刘维权，刘海鹏，等.人胰岛素因基重组杆状病毒在家蝇中表达的研究.中国医科大学学报，2004，33（2）:113.
8 叶应妩，王毓之.全国临床检验操作规程，南京:东南大出版社，1991，158.
9 Bliss M.The history of insulin.Diabetes Care，1993，16Suppl（3）:4-7.
基金项目:辽宁省重点资助项目（项目编号:2001408001）
作者单位:1110001沈阳中国医科大学实验动物部
2130062长春解放军军需大学军事兽医研究所
3100094北京中国农业大学生物学院