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1 材料与方法
1.1 病例来源及样品 5例病人中，4例为临床经血红蛋白电泳确诊为“HbH病”的病人，1例为筛查中发现，其中儿童4例，孕妇1例。均采取病人静脉血1ml（筛查标本取自末梢血0.1ml），均用EDTA抗凝，4℃保存，1～2天内提取DNA，进行地中海贫血的基因检测。
1.2 基因组DNA提取用复方Chelex-100法提取DNA ［2］ 。
1.3 缺失型α-地贫的多重PCR筛查，按本室方法 ［2］ 先进行缺失型α-地贫的多重PCR筛查，检定- SEA DNA片段是否出现及α 2 基因是否存在。若出现- SEA 基因特异性片段，同时缺乏α 2 基因的特异性片段者，考虑为缺失型HbH病;若出现- SEA 基因特异性片段而α 2 基因片段仍存在，考虑为非缺失型HbH病。
1.4 非缺失型α-地中海贫血α 2 基因检测 在中国非缺失型α-地中海贫血α 2 基因以Hb Constant Spring及Hb Quong Sze常见 ［3，4］ 。HbCS特异性基因按Fucharoen的方法检测 ［3］ ，HbQS特异性基因按S Ling等 ［4］ 人的突变位置基因扩增和MSPⅠ内切酶分析法进行，略有修改。
1.4.1 α 2 基因片段扩增 引物位于Gene BANK No HUMHˉBA4，引物序列为:上游5’-TTGCGGGAGGTGTAGCGCAG-3’（7196～7215）;下游5’-GAAACACCTCCATTGTTGG-3’（7538～7558）。
1.4.2 PCR反应体系 含基因组DNA0.1～0.2μg，采用MBI DNA聚合酶缓冲体系，dNTP200pmol，引物（P 1 、P 2 ）各12.5pmol，MBI Taq0.8U，反应总体积25μl。
1.4.3 反应条件 将上反应体系在美国PTC-100型基因扩增仪进行反应。预处理94℃2min，然后94℃30s，58℃30s，72℃30s，32个循环后72℃延伸5min，然后置4℃保存。
1.4.4 鉴定 取5μl扩增产物在含EB的2%NuSieve3:1agarose凝胶电泳，然后在紫外灯下观察。扩增产物仅1条区带为363bp，没有非特异性扩增产物。
1.4.5 限制性内切酶反应 取扩增产物15μl+H 2 O5μl，缓冲液2μl，MSPⅠ10U/μl，加石蜡油20μl，在37℃反应1h，在含EB的3%metaphor agarose凝胶电泳，电泳梯度5V/cm，电泳40min后鉴定。不含HbQS变异的α珠蛋白基因可见:70bp和264bp2条区带;HbQS DNA可见，70bp，122bp，142bp3条区带;29bp区带弥散在BPB前方，看不清楚。
2 结果
我们用多重PCR筛查缺失型α-地中海贫血基因时，发现5例患者- SEA /特异性基因片段区带680bp及α 2 基因特异性片段190bp区带同时存在，Hb电泳中又出现HbH区带，考虑为非缺失型HbH病，见图1。这5例HbCS经基因检测均未见含Hb Constant Spring的特异性DNA片段，经部分特异性α 2 基因片段的扩增均呈1条363bp区带随后进行限制性内切酶酶解。酶解产物分析，正常对照可见3条区带:70bp、264bp区带清晰，29bp区带弥散在溴酚兰前方。5例非缺失型HbH病患者可见4条区带:70bp、122bp及142bp3条区带清晰，29bp区带弥散在溴酚兰前方。基因分析证实5例患者均含HbQS，见图2。
图1 α地中海贫血多重PCR电泳结果（略）
图2 HbOS酶切电泳结果（略）
3 讨论
目前国际上共有20多种非缺失型α地中海贫血报道，就东南亚和中国南方来说，最常见的非缺失型为Hb Conˉstant Spring及Hb Quong Sze ［3］ 。二者分别与α地贫 1 相互作用，产生HbH-CS病及HbH QS病，其临床表现要比缺失型HbH严重，查明非缺失型HbH病的基因类型，对临床有重要意义。Hb Quong Sze病，在我国广东、广西 ［4］ 已有报告，但较HbCS少见。海南尚未有报道。目前已检出5例非缺失型HbH病，均为HbQS病。
Hb Quong Sze的基因缺陷为α 2 珠蛋白基因codon125Leu→Pro（CTG→CCG） ［4］ 。由于突变发生在外显子Ⅲ内，这一区域的密码子蛋白质在α 1 β 1 珠蛋白链的接触当中起重要作用，而这是有效血红蛋白聚合所必需的。突变导致翻译后肽链极不稳定，易于被蛋白酶水解，而影响α链的合成，出现临床症状。这种变异Hb分子没有正或负电荷的改变，所以，普通的Hb电泳不出现异常区带，只有通过基因检测的方法才能诊断。
早期非缺失型α地贫的诊断，为利用限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）连锁分析进行诊断，随着PCR方法的建立，结合等位基因特异寡核苷酸探针（ASO）方法和利用其突变，导致丢失或获得一些限制性内切酶酶切位点来证实，是目前应用的比较多、比较简便的方法。正常发生α 2 珠蛋白基因7196～7558片段中有两个ccgg为MSPⅠ酶切位点，在Hb Quong Sze突变（CTG→CCG）后，增加了一个MSPⅠ的酶切位点，见图3。这样，用PCR方法扩增特定的α 2 基因的DNA片段产物，再用MPSⅠ进行酶解，可以将原来用MSPⅠ酶解只能切成3段的基因片段现在能酶切成4段而明确诊断。在实验中我们选用3%（Metaphor）琼脂糖凝胶电泳，可将小分子量DNA清晰分离而确定Hb Quong Sze的突变，比用聚丙烯酰胺凝胶电泳要经济和方便。HbQS的基因诊断较为困难复杂，故未在临床广泛应用。有鉴于此，我们对HbQS的诊断方法略加修改，使其操作起来简易、省时，有利于临床广泛应用。
图3 （略）
Hb Quong Sze只在中国人中发现 ［4］ ，我们发现的5例病人中，4例为汉族，籍贯分别为广西、广东信宜和海南儋州，1例是在黎族地区进行义诊时前来就诊的儿童中发现，是否有外来血统，未能进一步调查。
参考文献
1 区采莹，蒙晶，王传文，等.海南343名黎族小学生α-地中海贫血基因型调查.海南医学，1999，2:112-113.
2 区采莹，蒙晶，郑诗华.多重PCR筛查高发群体缺失型α-地中海贫血基因的研究.中国热带医学，2002，2（2）:129-131.
3 Supan Fucharoen，Goonnapa Fucharoen，Yasuyuki Fukumaki.Simplenon-rachioactive method for detecting hemoglobin Constant Spring gene.The Lancet，1990，335:1527.
4 S.Liang X-J，Wen W-X Lin.Detection od the HB Quong SZE mutaˉtion in a Chidese family by selective amplification of theα 2 -Globin gene and restriction MAP analysis with MSPⅠ.Hemoglobin，1991，15（6）:535-540.
作者单位:570102海南海口海南医学院附属医院儿科