氟化物免疫毒性的体外试验研究

    【摘要】 目的  观察氟化钠对免疫功能的影响。 方法  通过体外实验，运用MTT比色法、免疫荧光技术、淋巴细胞转化试验等实验方法，检测白细胞介素2活性、淋巴细胞膜白细胞介素2受体含量及外周血淋巴细胞转化功能。 结果  当氟离子浓度达30PPM时，即可抑制白细胞介素2活性、淋巴细胞膜白细胞介素2受体表达及外周血淋巴细胞转化功能。 结论  提示氟化钠具有免疫毒性。
    
　　【关键词】  氟化物 免疫毒性 体外试验
         
　　An experimental study on immunotoxicity of sodium fluoride in vitro
     
　　Song Shizhen，Gong Taiping
    
　　College of Medical Science，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan430080.   
     
　　【Abstract】 Objective To observe the effect of sodium fluoride on immune-function.Methods The inter-leukin2activity was observed by MTT colormietric assay，the interleukin2receptor expression of lymphocyte mem-brane was examined by immunofluoresence technique and lymphocyte blastogenesis in peripheral blood was measured by morphologic observation.Results interleukin2activity，interleukin2receptor expression of lymphocyte membrane and lymphocyte blastogenesis in peripheral blood were inhibited at and above30PPM concentration of fluorine ion.
Conclusion Fluoride can be suppressor on immune function.
   
　　【Key words】 fluoride immunotoxicity in vitro test
      
　　氟化物对机体免疫功能具有一定的毒性作用，对此国内外均有报道 ［1，2］ ，本研究通过体外试验，观察氟化物对白细胞介素2活性、淋巴细胞膜白细胞介素2受体表达及外周血淋巴细胞转化功能的影响，拟探讨氟化物免疫毒性的部分机制。
    
　　1 材料与方法
    
　　1.1 基础培养基配置 1640含25mM HEPES，16mM碳酸氢钠，2Mm-L谷氨酰胺，5×10 5 M2-巯基乙醇，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，再加入10%的热灭活小牛血清即成为完全培养基。

    1.2 IL-2的诱生 PBMC2×10 5 /ml，取0.5ml加入含PHA、人血清的完全培养液0.5/ml，使细胞浓度为1×10 5 /ml，PHA为10μg/ml，人AB血清为5%，置37℃，5%CO 2 培养箱培养48h，吸出置试管内离心2000r/min，20min，取出上清液（含IL-2），存于-30℃。

    1.3 IL-2活性检测 传代细胞CELL-2细胞，待细胞生长良好时，用不含IL-2的完全培养基调整浓度至1×10 5 /ml，加入至96孔平底培养板，每孔50μl，再加入含氟离子浓度为0、6、60、600ppm的上述诱生上清液，每孔50μl，每种剂量6孔，置37℃，5%CO 2 培养24h，每孔加MTT（5mg/ml）20μl，继续培养4h，加甲替溶液100μl，37℃放置4h，用酶标仪检测每孔OD 570 ～OD 630 值，IL-2活性用OD 570 ～OD 630 表示。

    1.4 淋巴细胞悬液制备及染毒培养 胎儿脐带血加入内含等体积淋巴细胞分离液的试管内，2000r/min30min，取单个核细胞，PBS缓冲液洗涤3次后调整浓度至1×10 5 /ml，1%台盼蓝检测细胞的存活率。将上述淋巴细胞悬液0.1ml加入至含氟离子浓度分别为0、3、30、300（分别为A、B、C、D组）上述培养基（5ml）内，置37℃，5%CO 2 培养箱培养72h。

　　1.5 淋巴细胞膜受体含量检测 将上述淋巴细胞悬液吸入至试管内，用PBS缓冲液洗涤3次后，定容至0.1ml，取50μl加入第一抗体50μl混匀后置4℃30min，用含2%新生牛血清，Na 3 N1%的1640液洗涤3次，弃上清液，留沉淀细胞加入羊抗鼠IgG（二抗），4℃30min，洗涤3～6次，悬浮至原量后，滴片镜检，观察阳性细胞，计算百分率。
   
　　1.6 淋巴细胞转化试验 将上述染毒培养完毕的淋巴细胞洗涤3次，用甲醇及冰醋酸（1:3）预固定，点片，烘干，姬姆萨染色，观察阳性细胞，计算百分率。

　　2 结果
    
　　2.1 氟化物对IL-2活性的影响 各组不同氟离子浓度对IL-2活性的影响的结果表明氟离子浓度在30ppm时即显明显抑制作用，并呈负相关关系（见表1）。
    
　　表1 不同氟离子浓度白细胞介素2活性的影响略
    
　　2.2 氟化物对淋巴细胞膜IL-2受体表达的影响 表2所示，各组淋巴细胞膜IL-2受体含量差异具有显著性。
　　表2 各组淋巴细胞膜IL-2受体含量比较略
    
　　2.3 氟化物对淋巴细胞膜转化功能的影响 氟体外染毒培养淋巴细胞转化情况表明，氟离子浓度在30ppm时，即可对淋巴细胞转化产生抑制作用（见表3）。
    
　　表3 各组淋巴细胞转化率比较略
    
　　3 讨论
    
　　IL-2又称细胞生长因子，被认为是免疫调节的中枢性分子，它能刺激Th、CTL、NK、B细胞的生长，并能诱导杀伤细胞产生γ-干扰素、α肿瘤坏死因子和刺激B淋巴细胞产生特异性抗体，因此，在免疫调节过程中能增加机体的免疫功能。有报道显示氟暴露人群血清中IL-2含量降低 ［3，4］ 。本研究结果表明氟离子浓度在30ppm时，IL-2的活性明显低于对照组，这可能与氟离子对细胞的直接毒性作用或氟离子作用IL-2，使其结构发生改变，从而引起其活性发生变化有关。
   
　　T、B、NK及单核巨噬细胞膜上具有IL-2R，但在正常状态下，上述细胞膜上IL-2R含量均很少，只有在受到抗原物质、有丝分裂原等刺激时，才能在膜上大量表达，其中以T淋巴细胞表达最多。T淋巴细胞膜IL-2R表达含量与其被激活程度呈正相关关系，膜IL-2R密度是决定细胞增值反应程度的变量之一，除去抗原、有丝分裂原等外界因素，T细胞增值周期的进展仅依赖3个变量，即IL-2R的浓度、IL-2R的密度以及IL-2R与IL-2相互作用的持续时 间，在体外用PHA刺激人淋巴细胞，使T淋巴细胞多个克隆被激活，可发现这些淋巴细胞并非同时表达IL-2R。在本研究中，我们发现在30ppm氟离子染毒培养的淋巴细胞，培养72h后其死亡率即有增高趋势，300ppm组的淋巴细胞死亡率达30%，并且死亡的细胞绝大多数均为淋巴母细胞，这提示氟对增殖的淋巴细胞有明显的细胞毒性作用。虽然有研究表明氟暴露人群血清中游离IL-2R含量与非暴露人群比较无明显不同 ［5］ ，但本次实验显示染毒培养的淋巴细胞膜IL-2R表达，在3ppm氟离子剂量时与对照组比较差异无显著性，在30ppm氟离子染毒培养剂量时，则表达显著下降，在300ppm氟离子染毒培养剂量时，淋巴细胞膜IL-2R表达反而介于3ppm与30ppm剂量组之间，这可能与死亡的淋巴细胞易产生假阳性，从而导致检测结果的偏高有关。本次研究的结果表明氟化钠对培养人淋巴细胞膜IL-2R的表达具有一定的抑制作用，原因可能有:（1）氟染毒培养的淋巴细胞IL-2R产生并在膜上表达的含量减少;（2）氟染毒培养的淋巴细胞膜上表达的IL-2R结构发生改变;（3）氟染毒培养的淋巴细胞膜IL-2R与IL-2结合受到抑制。
   
　　淋巴细胞转化能力是反应机体自身免疫功能的重要指标之一，氟对淋巴细胞转化能力具有抑制作用，对此已有报道 ［6］ 。在本研究条件下，我们发现，当氟浓度为30ppm时，体外染毒培养的淋巴细胞转化率即明显下降，除了上述原因，可能还与氟离子体积小，所带负电核密度大，能与酶分子辅基中的阳性离子以共价结合，从而改变酶分子活性中心与周围的辅基依靠氢键而缔结形成的平衡结构，酶的活性受到抑制，影响细胞的能量代谢和生物大分子物质的合成有关。
     
　　参考文献
    
　　1 吴岩，吴德清.氟对机体的免疫毒性作用.中国地方病学杂志，1995，14（5）:298-300.

    　2 郭智勇，朱启星.高氟暴露对机体免疫损伤的研究进展.疾病控制杂志，2001，5（2）:145-147.

   　 3 宋世震，徐增光，陈荣安，等.慢性氟中毒对白细胞介素-2活性的影响.环境与健康杂志，1995，12（5）:228-229.

   　 4 张海谋，宋世震，郑红燕，等.氟暴露工人血清白细胞介素2含量的变化及其意义.中国工业医学杂志，1998，11（4）:197-199.

　　5 宋世震，刘建东，陈荣安，等.氟对人体血清免疫功能的影响.工业卫生与职业病，1995，21（5）:280-281.

   　 6 宋世震，章孟本.氟暴露工人免疫功能的检测及氟化钠对体外培养淋巴细胞转化的影响.工业卫生与职业病，1992，18（4）:2199-2201.      

　　作者单位:430080武汉科技大学医学院预防医学系