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关键词 贲门癌 细胞因子 Thl/Th2 流式细胞术
Clinical signficance of TH1/TH2cytokines
in the peripheral blood lymphocytes of patients with cardia cancer
Wu Ping，Chen Jie，He Huijuan，et al
The Central Laboratory，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang，Guangdong524001.
【Abstract】 Objective To detect the level of Th1and Th2type cytokines of peripheral blood CD3+T lymˉphocytes in the patients with cardia cancer.in order to find out the laboratory evidence of tumor immunotherapy.Methods The peripheralblood lymphocytes were stimulated by stimulator in order to enhance expression of cyˉtokines.Specific fluorochrome-conjugated monoclonal antibody combined withantigen.Cytokines were detected by flow cytometry and ELISA.Results The level of Th1type cytokines such as interferon-γ（IFN-γ），interleukin-2（IL-2），interleukin-12（IL-12）were significantly lower in patients of cardia cancer than those of normal conˉtrols.The level of Th2type cytokines such as interleukin-4（IL-4），interleukin-10（IL-10）were higher in paˉtients of cardia cancer than those of normal controls，there were significant difference between them.The levelof tuˉmor necrosis factor a（TNF-a）in patients were significant higher than normal control.Conclusion Th1/Th2was imbalance in cardia cancer.Th1type cytokineswere inhibited，and Th2type cytokines were relatively enhanced，so Th1/Th2shiftto Th2.It maybe the mechanism of tumor arising and transferring by immune escaped from immunoˉsurveillance.
Key words cardia cancer cytokines Th1/Th2 flow cytometry
辅助性T细胞（Th）对机体免疫系统有重要的调节作用。人在正常的生理情况下，Thl、Th2两类细胞处于相互抑制、相互转化的平衡状态，一旦平衡被打破，机体就会处于Thl优势或Th2优势的漂移状态，从而出现各种病理反应，甚至发生肿瘤 ［1～4］ 。Thl细胞、Th2细胞这两种细胞均表达CD3、CD4抗原 ［5］ ，一般的免疫生化方法不能进一步区分这两种细胞，目前可利用流式细胞仪检测单个特应细胞分泌的特异性细胞因子水平 ［6］ ，分析其免疫细胞活动状态，从而有望研究出调控免疫反应的一套方法。我们应用流式细胞仪通过Cytodetect TM 试剂盒检测贲门癌患者CD3+T细胞分泌细胞因子的表达水平，用ELISA法检测血清中相应的细胞因子水平，分析贲门癌患者的Thl细胞和Th2细胞免疫活动状态，为防治贲门癌提供实验依据。
1 对象与方法
1.1 对象与试剂
1.1.1 对象 贲门癌患者55例，年龄44～84岁（平均62.5岁），男43例，女12例，其中高分化腺癌19例，中分化腺癌16例，低分化腺癌20例，根据UICC（国际抗癌联盟）:标准TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期22例，Ⅲ期19例，Ⅳ期14例，所选病例均经临床和病理诊断证实。正常对照30例，年龄42～75岁（平均58.5岁），均为健康查体者。
1.1.2 仪器 美国Coulter EPICSXL型流式细胞仪，美国Bio-Rad550型酶标仪，美国NAPCO5410型二氧化碳培养箱，日本三洋MDF-3820型-70℃超低温冰箱，上海安亭科学仪器厂TDL-5A型离心机。
1.1.3 主要试剂 Cytodetect TM 试剂盒系荷兰IMMUNO QUALITY PRODUCTS公司产品。RPMll640培养液系美国GIBCO公司产品。淋巴细胞分离液系上海华精生物高科技有限公司产品。白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）和TNF-αELISA检测试剂盒系美国GeneMay公司产品。白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-12（IL-12）和干扰素-γ（IFN-γ）ELISA检测试剂盒系美国Genzyme公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 采集标本 所有患者均在手术前、部分病人在术后1个月及化疗后分别抽取静脉血7ml，其中2m1分离血清，-70℃冻存，用于细胞因子的ELISA测定;5ml血肝素抗凝，用于Cytodetect测定。
1.2.2 Cytodetect测定 采用Cytodetect TM 试剂盒提供的方法。分离外周血淋巴细胞:采用Ficoll密度梯度离心法常规分离外周血淋巴细胞，所分离的淋巴细胞用RPMl l640培养液稀释为1×10 6 细胞/ml备用。刺激细胞:①将1ml淋巴细胞悬液置于24孔培养板，培养孔加A试剂10μl，B试剂10μl，C试剂10μl。②37℃，5%C0 2 培养箱孵育5h。③刺激后转移细胞于一新离心管，加5ml洗涤剂洗涤，离心（1200r/min×10min），弃去上清液。固定细胞:①加500μl冻固定液（4℃），室温下孵育10min。②加9ml洗涤剂洗涤，离心（1200r/min×10min），弃去上清液，以1ml洗涤剂悬浮细胞，置4℃冰箱过夜。细胞表面抗原染色:①从4℃冰箱取出固定后细胞液，加5ml洗涤剂洗涤，离心（1200r/min×10min），弃去上清液，以500μl洗涤剂悬浮细胞。②取100μl 细胞悬液，加20μl抗细胞表面抗原的抗CD3-FITC，涡旋混匀，室温暗处孵育20min。细胞打孔:加1.5ml打孔液，离心（1000r/min×5min）。弃去上清液，以100μ1打孔液悬浮细胞。细胞因子染色:①加10μl抗细胞因子的单克隆抗体:抗IFN-γ-PE、抗TNF-α-PE、抗IL-2-PE、抗IL-4-PE、抗IL-10-PE、抗IL-12-PE，并另设一管加10μl该单克隆抗体的同型抗体。②4℃暗处孵育20min。③加1.5ml打孔液，离心（1000r/min×5min），弃去上清液，以100μl HBSS液悬浮细胞，2h内上流式细胞仪分析。
1.2.3 相应的细胞因子检测采用ELISA法，严格按说明书进行操作。
1.3 统计学处理 用SPSS10.0统计软件对实验数据进行统计学分析，数据以均数±标准差（X±s）表示，用单因素方差分析对样本均数之间的差异显著性进行检验，用非参数检验的二项检验对计数资料进行检验。
2 结果
2.1 贲门癌患者外周血CD3+T细胞表达IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-a细胞的百分比，见表1。贲门癌患者Thl型细胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ表达水平较正常对照组显著降低（P<0.01），而TNF-α表达水平较正常对照组显著升高（P<0.05）;Th2型细胞因子IL-4、IL-10表达水平与正常对照组升高，差异有显著性（P<0.05）。