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【摘要】 目的 探讨骨关节病（osteoarthritis，OA）发病过程中，关节软骨细胞基质合成状况的改变以及与IL-1β的关系。方法 取16例OA患者和6例正常对照者（均为50～60岁之间）的膝关节软骨。通过RT-PCR，检测各组标本中关节软骨细胞syndecan、Ⅱ型胶原、软骨蛋白聚糖（aggrecan）、骨连接蛋白（osteonectin）的合成水平。另取各例正常关节软骨细胞置于含1ng/ml IL-1β的培养液中诱导48h，RT-PCR检测其胞外基质（ECM）合成的改变。结果 OA患者的关节软骨细胞中aggrecan的表达显著下降（P<0.01），只有正常组的20%甚至更少;Ⅱ型胶原基本没有显著变化（P>0.05）;syndecan和osteonectin有显著上升（P<0.01），均达到正常组的2倍以上。正常关节软骨细胞经IL-1β诱导培养48h之后，aggrecan有显著下降（P<0.01），仅为原来的（47.34±5.83）%;Ⅱ型胶原保持不变;syndecan和osteonectin有显著上升（P<0.01），分别达到原来的（2.14±0.38）倍和（3.76±0.45）倍。结论 IL-1β非常显著的影响关节软骨细胞ECM的合成状态;它可能对OA患者关节软骨基质代谢紊乱起着重要的作用。
关键词 骨关节病 软骨 IL-1β 胞外基质
Changes of extracellular matrix expression in osteoarthritis
Liu Ming xuan，Ding Hao，Fan Haifeng，et al.
Department of Osthopedics，Putuo Medical University of TCM of Shanghai University，200062.
【Abstract】 Objective To study the changes of ECM expression in OA and their relationship to IL-1β. Methods The ECM（syndecan，typeⅡcollagen，aggrecan and osteonectin）expression in articular cartilage from 16 patients with OA and 6 controls was assessed by RT-PCR. The normal articular chondrocytes were induced by lng/ml IL-1βin vitro to evaluate the effects of ECM expression. Results The level of mRNA for aggrecan in OA chondrocytes decreased significantly（P<0.01）to about 20% in controls or even more less; the one for typeⅡcollagen had little changes（P>0.05）; the ones for syndecan and osteonectin increased more than 2-fold. After the induction of IL-1β，aggrecan expression in normal articular chondrocytes decreased to 47.34±5.83% compared to the controls（P<0.01）; typeⅡcollagen unchanged; syndecan and osteonectin increased 2.14±0.38 folds and 3.76±0.45 folds respectively. Conclusion IL-1βaffected the ECM expression in articular chondrocytes significantly，which may play an important role in ECM disorders in OA cartilage.
Key words osteoarthritss cartilage interleukin-1β extracellular matrix
在关节软骨的胞外基质（ECM）中，由软骨蛋白聚糖（aggrecan）、透明质酸和连接蛋白构成的蛋白聚糖复合物被包埋在庞大的胶原纤维网络中，担负着关节软骨重要的生理功能。胶原纤维的最主要成分为Ⅱ型胶原，其间还夹杂着少量的IX型和XI型胶原 ［1］ ，它们维持着关节软骨的正常结构。通过对OA患者软骨ECM表达水平的研究，我们希望初步阐明OA软骨代谢紊乱的机制，为OA的临床治疗提供参考。
1 材料和方法
1.1 标本获取和细胞培养 6例正常对照标本和16例OA关节软骨标本均取自本院骨科行关节置换的OA患者。各组软骨标本取下后，经生理盐水冲洗，去除碎屑，置于-70℃冻存待用。取部分正常软骨标本，0.2%胰酶37℃温育30min，0.15%胶原酶37℃消化过夜。2000r/min离心，所得细胞置于DMEM培养液（Gibco，含10%胎牛血清、300mg/L谷氨酰胺、50mg/L抗环血酸、青、链霉素各100u/ml）、37℃、 5%CO 2 培养。
1.2 IL-1β诱导 取80%左右融合的正常关节软骨细胞，换入含有1ng/ml IL-1β的DMEM培养液，诱导48h后，PBS漂洗，Trizol（GIBCO BRL）充分裂解，置于-70℃冻存待用。
1.3 RNA抽提 将各组冻存的软骨组织块剪碎，研磨成糜状，Trizol（GIBCO BRL）4℃，浸泡裂解过夜。当软骨组织完全溶解于Trizol中，呈乳状悬液后，与细胞裂解液一起按照常规方法分别抽提总RNA。
1.4 RT-PCR 将各组标本的mRNA逆转录为cDNA（2μl RNA/20μl体系，TaKaRa AMV Reverse Transcriptase XL）。2μl cDNA/20μl体系进行PCR反应（TaKaRa Taq）。退火温度及引物序列见表1，各组标本均重复3次。RT-PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳1h，电泳完毕后，在紫外灯下对各组条带进行光密度测定和比较。
1.5 统计学分析 各例样本至少重复3次，采用SPSS10.0软件对数据结果进行分析，P<0.05表示差异有显著性。
表1 PCR引物（略）
2 结果
2.1 正常组和OA组ECM的差异 由RT-PCR的电泳结果（见图1）可见，OA组aggrecan的表达显著下降（P<0.01），只有正常组的20%甚至更少;Ⅱ型胶原基本没有显著变化（P>0.05）; syndecan和osteonectin则显著上升（P<0.01），均达到正常组的2倍以上。
图1 正常组与OA组中主要ECM的表达（略）
2.2 IL-1β诱导软骨细胞ECM合成的改变 正常关节软骨细胞经1ng/ml IL-1β诱导48h后，部分ECM的合成发生了显著的变化（见图2）。Aggrecan的表达降至原先的（47.34±5.83）%; syndecan和osteonectin有显著上升，分别达到原先的（2.14±0.38）倍和（3.76±0.45）倍。但是，Ⅱ型胶原的表达保持较为稳定的状态，没有发生显著的变化（P>0.05）。1ng/mlIL-1β诱导1周以后，细胞内aggrecan、Ⅱ型胶原、syndecan和osteonectin的表达均显著下降（P<0.01）。
图2 IL-1β诱导软骨细胞主要ECM表达的改变（略）
3 讨论
OA是一种老年人群中常见的关节疾病，表现为以关节软骨退变损耗为特征的无菌性炎症，典型的病理进展为软骨组织结构进行性流失。这一过程，一方面可能是由于IL-1β以及NO等相关因子对细胞损伤导致细胞活力下降和细胞凋亡增加造成的［2］ ;另一方面，可能与IL-1β促进软骨和滑膜组织中基质金属蛋白酶（MMP）的表达 ［3］ ，抑制软骨细胞ECM的合成有密切联系。根据本实验室已有的研究结果发现，IL-1β对关节软骨细胞的促凋亡之作用和MMPs的表达上调作用有非常显著的生物学功能。为了进一步阐明IL-1β及OA发病机制的整体影响，通过本实验，我们着重探讨了IL-1β与关节软骨细胞的ECM合成水平的关联。Ⅱ型胶原和aggrecan是构成软骨组织ECM的最重要成分。Aggrecan单体上带有数量众多的硫酸软骨素和硫酸角质素等负电荷基团，这使它的大分子聚合物在Ⅱ型胶原纤维的网络架构中高度水合。Aggrecan与胶原纤维复合物的生物学特性赋予关节软骨组织承受外力，恢复弹性形变的能力。当aggrecan的分解增加，合成减少时，糖胺聚糖基团上所携带的负电荷亦随之丢失，造成关节软骨不再具有正常的生理功能 ［4］ 。本实验对临床获取的组织块标本检测的结果，可以发现在OA患者的关节软骨细胞中aggrecan的表达仅为正常关节软骨细胞的20%甚至更少。这就足以证明OA患者关节部位的软骨细胞丧失了极其重要的表型特征，同时由于aggrecan的异常减少造成软骨组织的基质结构不完全，水合能力下降。进一步的细胞学实验证明，关节软骨细胞aggrecan合成的减少很大程度上是由于高浓度IL-1β的作用及其后继的信号传导途径中级联分子的激活。但是，对Ⅱ型胶原的检测结果却与相关的研究报道略有不同 ［5］ 。在大部分OA患者的关节软骨细胞中，Ⅱ型胶原的表达并没有显著下降，仅有个别晚期病人的组织标本检测显示有显著下降，这一结果可能是由于采用了不同的检测手段的缘故。我们所进行的RT-PCR检测仅涉及细胞自身的表达调控状况，而免疫组化等其他方法则牵涉到细胞的合成水平、转录后修饰的水平、以及分解代谢水平等多方面的综合因素。另外，由于造成OA的发病原因非常复杂，可能还与遗传背景的个体差异和病程的长短有关，这需要我们进行深入的研究。
Syndecan是一种硫酸肝素蛋白聚糖，可以与bFGF结合，使bFGF在细胞表面积聚，这些积聚的bFGF会刺激细胞内相关基因在短时间内活化。bFGF刺激MMP-1和MMP-9的表达 ［6］ ，当MMPs合成上升，对蛋白聚糖的降解加快时，bFGF会从syndecan上被解离并释放。bFGF还是一种强烈的促血管生成因子，OA患者关节部位血管侵入软骨组织，可能与之有关。Osteonectin与正常软骨的矿化有关 ［7］ ，在OA患者关节处，osteonectin一般均有升高 ［8］ ，并且osteonectin的表达遍布OA患者关节软骨的整个钙化层 ［9］ 。我们的临床标本检测结果证实了这一观点，并且我们发现它的合成上升与高浓度IL-1β的信号传导途径有关。1ng/ml IL-1β对正常关节软骨细胞诱导1周以后，各种ECM的表达均显著下降，可能并非是IL-1β直接作用的结果，而是因为软骨细胞长期暴露在高浓度IL-1β中，细胞损伤加剧，大量进入凋亡过程的缘故。另一方面，关节软骨细胞长期体外单层培养，细胞老化现象也是一个值得考虑的因素。
结合本实验室各项实验的研究数据，我们发现OA患者关节局部IL-1β释放增加、浓度上升，不仅导致了关节软骨细胞MMPs表达和活性的异常升高，还严重影响关节软骨细胞正常ECM的合成代谢过程，软骨ECM重要成分aggrecan合成大幅减少，而与血管化、钙化相关的syndecan、osteonectin的合成则有明显上升。上述的多方面因素综合作用，推动了OA病理进展过程。
参考文献
1 Bruckner P，van der Rest M.Structure and function of cartilage collagen. Micro Res Tech，1994，28:378-384.
2 Westacott CI，Whicher JT，Barnes IC. Synovial fluid concentration of five different cytokines in rheumatic diseases. Ann rheum Dis，1990，49:676-681.
3 Hamilton JA，Butler DM，Stanton H. Cytokine i