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关键词 骨性关节炎 膝关节 白细胞介素-1 基质金属蛋白酶-13
Zhang Ying，Zhang Xiaonan，Guan Jikui
Department of Orthopaedics，The First Hospital of Jilin University，Jilin130021.
【Abstract】 Objective To study the relationship between IL-1，MMP-13and pathogenesis of knee osˉteoarthrosis.Methods IL-1and MMP-13were measured concurrently in synovial fluid samples from23patients with mild OA，28patients with severe OA and6patients with disciform meniscus.The determinations of positive rate of cells in genual synovium with IL-1and MMP-13were carried out using immunohistochemical techonology.The deˉterminations of content of IL-1and MMP-13in synovial fluid was performed by ELISA.Results IL-1and MMP-13were found in all patients’synovial fluid.There was not apparent difference in the concentration of IL-1and MMP-13in synovial fluid and synovium between patients with light OA and patients with disciform meniscus（P>0.05）.The concentration of IL-1and MMP-13in in synovial fluid and synovium from patients with severe OA was higher than those from light OA and discifrom meniscus（P<0.05）.Conclusion IL-1and MMP-13might be inˉvolved in regulating the pathogenesis of OA.Human synoviocyte are able to secret IL-1and MMP-13in response to physiologic and inflammatory stimuli，which is the main source of IL-1and MMP-13in synovial fluid.
Key words osteoarthritis knee joint interleukin-1 matrix metalloproteinase-13
骨性关节炎（OA）是骨科临床常见的疾病。近年来伴随世界老龄化人口的增加，OA会变得更为普遍，可能成为21世纪的头号疾病。本研究通过检测滑膜组织及关节液中IL-1、MMP-13的含量，旨在探讨白细胞介素-1（IL-1）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）在膝关节骨性关节炎发病中的作用，为防治OA提供依据。
1 材料与方法
1.1 标本来源 关节液及滑膜组织57例，共57膝，均来自吉林大学第一医院骨科关节镜室，全部标本为2003年3月～2003年9月膝关节镜检查及治疗手术中所取活检标本。通过关节镜所取的滑膜组织经甲醛固定、石蜡包埋，做连续4μm切片，并做常规HE染色。术前抽取的关节液于冰箱-20℃保存。
1.2 OA诊断标准 膝关节疼痛1年以上;晨僵，胶滞现象;蹲起困难，膝关节肿胀史;膝关节间隙压痛，膝关节弹响及摩擦感;膝关节X线改变，五项以上可以考虑诊断，并于术中给予明确诊断。
1.3 病例分组 根据X线片Altman和Ahlback X线分级法 ［1］ 及膝关节镜诊断分为两组，第一组（病变轻微组）:OA患者膝关节X线片分级为1、2级，23膝，男11例，女12例，平均年龄55.6岁，病程为2年以下;（见图10）:第二组（病变严重组）:OA患者膝关节X线片分级为3级以上，28膝，男10例，女18例，平均年龄57.8岁，病程为2年以上。（见图15）。6例盘状半月板患者定为对照组，6膝，男3例，女3例，平均年龄18.0岁。
2 实验方法
2.1 滑膜组织IL-1及MMP-13免疫组织化学研究
2.1.1 免疫组织化学试剂 IL-1抗体及MMP-13抗体，Sp-kit试剂盒包括正常血清、生物素化抗兔第二抗体及链霉素化亲合素，DAB-kit显色剂等均为即用型，购自北京鼎国公司。。
2.1.2 染色步骤 免疫组织化学染色采用SP法 常规切片脱蜡至水（二甲苯Ⅰ30min→二甲苯Ⅱ30min→100%酒精Ⅰ5min→100%酒精Ⅱ5min→80%酒精5min→蒸馏水洗）;抗原修复:枸橼酸缓冲液→加热98℃5min;水洗;H 2 O 2 阻断内源性过氧化物酶30min;0.01M PBS洗3×5min;血清覆盖20min;甩去多余液体加第一抗体（IL-1或MMP-13）4℃过夜;PBS洗3×5min;滴加生物素化IgG第二抗体，室温孵育30min，PBS洗3×5min;滴加辣根过氧化物酶标记链霉素化亲合素第三抗体室温30min，PBS洗3×5min;滴加显色剂DAB，镜下控制染色，蒸馏水冲洗终止显色，自来水充分冲洗;Marry苏木精复染，脱水、透明、中性树胶封片。
2.1.3 结果判断、分析与统计 显微镜下观察染色切片，并用目镜网格测微尺任选10个视野（400×），每个视野下进行100个细胞中阳性细胞计数，以均值±标准差表示。同时对染色强度评价。
2.1.4 统计学处理 全部数据采用SPSS9.0进行统计学处理，各组间比较采用组间t检验进行统计。
2.2 ELISA法检测关节液中IL-1及MMP-13水平
2.2.1 试剂 IL-1及MMP-13ELISA试剂盒购于北京鼎国公司。
2.2.2 操作方法（夹心ELISA法） 包被:用包被缓冲液稀释包被单抗，加入聚苯乙烯酶标板中，每孔加入100μl，4℃过夜;弃去包被液，每孔加入200μl封闭液，置37℃2h，弃之，以PBS洗涤液洗2次，甩干;加样:每孔加入100μl待测标本，设置空白对照，并加入不同浓度标准品稀释液，轻轻振动混匀，置37℃2h，弃之，以PBS洗涤液洗3次;加酶标抗体;加入HRP标记的抗体，每孔加入100μl，37℃2h，弃之，以PBS洗涤液洗3次;显色:每孔加入DAB底物液100μl，室温避光反应10min，加入50μl中止液，酶标仪490nm测定OD值。
2.2.3 绘制标准曲线 以标准品浓度对数为横坐标，以OD值为纵坐标，去除空白对照组OD值，绘制标准曲线。并计算相应的回归方程。
2.2.4 计算含量 以样品OD值减去空白对照OD值，按相应的回归方程计算样品IL-1及MMP-13含量。
3 结果
3.1 OA患者膝关节镜检查结果 对照组患者膝关节镜见滑膜无增生肥厚，关节软骨光滑润泽。第一组患者膝关节镜下见软骨损坏较轻，可见表面纤维化，少部分蟹肉样改变;滑膜增生充血、绒毛广泛增粗纤维化，无粘连。第二组患者膝关节镜见软骨损坏严重，坏死脱落，表面凹凸不平、骨面外露。滑膜增生充血，绒毛广泛增粗纤维化，可见部分粘连。
3.2 滑膜组织IL-1、MMP-13免疫组织化学研究结果 组内分布不均匀，病变轻微组个别病例IL-1、MMP-13阳性细胞率较病变严重组高，但总体统计结果表明病变严重组IL-1、MMP-13阳性细胞率与其他两组比较差异有显著性。滑膜组织IL-1、MMP-13免疫组织化学结果见表1、2。
表1 滑膜组织IL-1免疫组织化学结果（略）
注:病变轻微组与对照组比较，P>0.05;严重组与对照组和病变轻微组比较，P<0.05
表2 滑膜组织MMP-13免疫组织化学结果（略）
注:病变轻微组与对照组比较，P>0.05;严重组与对照组和病变轻微组比较，P<0.05
3.3 膝关节关节液中IL-1、MMP-13水平 对照组（骨关节病组）患者膝关节关节液中IL-1、MMP-13含量如表3、4所示，第一组（关节软骨损伤较轻组）IL-1、MMP-13含量相对比较稳定，与盘状半月板组比较无差异。第二组（关节软骨损伤严重组）IL-1、MMP-13水平明显升高，但组内分布不均匀，个别病例IL-1、MMP-13水平轻微降低，但总体统计结果表明病变严重组IL-1、MMP-13水平与其他两组比较差异有显著性（P<0.05）。
表3 膝关节关节液中IL-1水平（略）
注:病变轻微组与对照组比较，P>0.05;严重组与对照组和病变轻微组比较，P<0.05
表4 膝关节关节液中MMP-13水平（略）
注:病变轻微组与对照组比较，P>0.05;严重组与对照组和病变轻微组比较，P<0.05
4 讨论
4.1 OA患者关节镜下所见及关节中IL-1、MMP-13含量 目前认为IL-1、MMP-13是OA滑膜炎症反应的主要调节剂。本实验证实OA患者关节滑膜细胞及关节液中存在大量IL-1、MMP-13，关节滑膜细胞能自分泌IL-1、MMP-13，OA患者关节滑膜细胞处于高分泌IL-1、MMP-13状态，是关节滑液中IL-1、MMP-13的主要来源之一。
本组57份膝关节滑膜组织及关节滑液标本中，无论是对照组还是OA组中，均能测出IL-1、MMP-13。OA病变轻微组膝关节滑膜组织及关节滑液标本中IL-1、MMP-13含量与对照组比较差异无显著性（P>0.05），OA病变严重组膝关节滑膜组织及关节滑液标本中IL-1、MMP-13含量与病变轻微组和对照组比较差异有显著性（P<0.05）。这说明OA组无论滑液中IL-1、MMP-B水平，还是滑膜细胞分泌的能力均高于对照组，且OA患者的病程越长、症状越重，滑膜细胞及关节滑液中IL-1和MMP-13含量增多就越显著，提示IL-1介导基质金属蛋白酶抑制物（TIMP）与基质金属蛋白酶（MMPs）之间失衡，是其引起软骨分解的主要机制，IL-1还有快速强大的促炎作用，同时IL-1介导的MMPs的释放也与滑膜炎有关，能进一步加强IL-1对软骨的分解作用。而IL-1刺激成纤维细胞Ⅰ型胶原的合成，是OA滑膜纤维化程度增加的原因。
本研究发现膝关节滑膜细胞能分泌大量IL-1、MMP-13，这与免疫组化研究中滑膜衬里层细胞存在IL-1、MMP-13相一致 ［2］ 。但OA组中有第一组个别病例滑膜组织及关节滑液标本中IL-1、MMP-13含量较第二组含量高，这可能与在病变轻微组中个别病例膝关节受外伤刺激使滑膜组织炎症反应增强、症状加重有关。另外其它细胞因子的相互作用也可能有一定影响，如TGF-β能降低IL-1、MMP-13的生物学作用 ［3］ 。
4.2 IL-1、MMP-13在OA中的作用机制 尽管OA病因复杂并存在争议，但该病总伴有不同程度的滑膜炎症。目前认为滑膜炎在OA发病中起着重要的作用，它可加速软骨基质的分解代谢，加速软骨退变。已证实这一过程与OA组织中蛋白水解酶，如金属蛋白酶活性增高密切相关，而滑膜分泌的细胞因子IL-1对金属蛋白酶和其它蛋白水解酶的合成起着重要的调节作用 ［4］ 。
IL-1是最经典的炎症调节剂，是调节炎症的始终因素，早在70年代Howell等在体外培养巨噬细胞时发现其上清液能促进软骨的降解，并促进软骨细胞分泌金属蛋白酶。IL-1是有多种细胞产生的 ［5］ ，如巨噬细胞、软骨细胞、滑膜细胞等，有IL-1α和IL-1β两种亚型。有学者报道培养膝关节滑膜细胞后，其上清液有IL-1主要以IL-1β为主 ［6］ ，它是构成细胞外IL-1的主要成分。炎症情况下，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）水平升高，它也能促进IL-1的上调作用，增加IL-1β的合成;另外关节滑膜细胞也可自分泌IL-1β。Pelletier等 ［7］ 在OA滑膜中发现，即使是早期患者，应用免疫组化技术也能发现IL-1β存在于关节滑膜衬里层细胞，并在深层组织染色，Shinmei等 ［8］ 报道IL-1β存在于关节软骨细胞中，而在外周血管翳以及淋巴细胞聚集的地方则较少，它能促进软骨和滑膜组织金属蛋白酶的表达，包括基质溶酶、胶原酶、组织纤维蛋白溶酶激活剂等;能辅助B细胞生长、诱导内皮细胞粘附因子的表达;能抑制软骨细胞Ⅱ型前胶原mRNA的表达、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成，具有骨吸收作用。 IL-1水平升高，可刺激滑膜细胞产生胶原酶和中性蛋白酶等，Ehrlich等采用OA实验动物模型实现，OA关节软骨中胶原酶、中性蛋白酶的活性在软骨破坏最严重的部位最高。说明破坏与软骨酶的降解作用有关。IL-1可诱发以单核细胞纤维渗出为特征的慢性滑膜炎，软骨基质降解产物的刺激也可引起滑膜的继发炎症。IL-1还可促进软骨细胞分泌PGE 2 ，PGE 2 参与关节炎症反应，刺激骨吸收，并可刺激成骨细胞样细胞增殖，导致关节骨、软骨增生性变化 ［9］ ，软骨下骨增厚，边缘长出新骨形成骨赘。IL-1、TNF-α和PGE 2 三者相互协同，促进软骨基质的破坏。Venn等利用OA动物模型研究报道，IL-1通过IL-6介导抑制软骨糖蛋白的合成，促进成纤维细胞合成和基质微分子的降解，加重软骨的损伤。关节内局部高水平的IL-6，可能与其影响软骨细胞增殖、软骨损伤的反应性和增强关节炎性反应有关，还可促进IL-1诱导金属蛋白酶分泌。另外，IL-6是促进B淋巴细胞增殖、分化产生抗体的必需因子，当水平升高时，会增强机体对软骨等组织的自身免疫应答，加重软骨的退变。
MMP-13是近年来在OA发病机制中研究得较多的几个指标之一。选择MMP-13作为研究指标的另一原因是MMP-13属MMPs中的胶原酶亚家族，可直接降解软骨基质中最具特征、含量也最多的Ⅱ型胶原，而且其它许多MMPs亚型对Ⅱ型胶原降解需要通过它起作用。因此理论上讲MMP-13胶原酶的变化最能反映出软骨基质中Ⅱ型胶原的代谢变化。
关节滑膜细胞分泌的IL-1、MMP-13可部分解释OA的病理过程，IL-1、MMP-13的存在可能在炎症关节中起着重要作用。虽然越来越多的学者重视到滑膜细胞、软骨细胞分泌IL-1、MMP-13的作用，但主要是研究外源性IL-1、MMP-13对软骨细胞或滑膜细胞的影响，而其内源性IL-1、MMP-13在OA发病中的作用及二者在OA发病中的联合作用却未广泛开展研究。本研究同时测定关节滑液和滑膜细胞分泌IL-1、MMP-13的生物浓度，初步了解OA内源性IL-1、MMP-13的作用，探讨IL-1、MMP-13与OA发病的关系，有利于OA的防治。
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作者单位:130021吉林大学第一医院