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【摘要】 目的 研究骨关节病的进程与关节软骨中Ⅹ型胶原代谢改变的关系。方法 取15例OA患者和5例正常对照者（均为50～60岁之间）的关节软骨。以Northern杂交、RT-PCR和Western杂交，检测各组样品Ⅹ型胶原的表达和代谢状况。结果 Northern杂交与RT-PCR的结果均显示OA患者的关节软骨细胞中Ⅹ型胶原在mRNA水平有显著升高。只是Northern杂交结果的差异有非常显著性（P＜0.01）；而RT-PCR结果的差异仅是有显著性（P＜0.05）。Western杂交可见OA患者的关节软骨基质中，Ⅹ型胶原的含量上升。但对比各组样品中mRNA与蛋白水平的变化趋势，其间并无显著的相关性（P＞0.05）。结论 骨关节病患者的关节软骨中，Ⅹ型胶原的代谢失调，导致基质组分发生改变，最终使软骨组织结构脆弱，易于崩解。
【关键词】 骨关节病；Ⅹ型胶原；关节软骨；基质
The changes of type-Ⅹ collagen metabolism in osteoarthritic articular cartilage
LIU Ming-xuan，DING Hao，PANG Jin-hui，et al.Department of Orthopedics，Putue Region Central Hospital，Shanghai 200062，China
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the pathogenesis of osteoarthropathy and the changes of type-Ⅹcollagen metabolism. Methods The articular cartilage from 15 patients with OA and 5 controls （age 50～60 years） were studied respectively. The synthesis and catabolism of type-Ⅹ collagen was measured by Western Blot analysis，Northern Blot and RT-PCR. Results At mRNA level，Northern blot analysis revealed OA articular chondrocytes with significantly higher type-Ⅹ collagen expression（P＜0.01）. Whereas，RT-PCR showed weak difference between OA and controls（P＜0.05）. The synthesis and deposition of type-Ⅹ collagen in OA cartilage matrix increased significantly compared with the healthy age-matched controls（P＜0.01） shown by Western Blotting. But there was no correlation between mRNA and protein synthesis of type-Ⅹ collagen（P＞0.05）. Conclusion The disorder in type-Ⅹ collagen metabolism in articular cartilage can contribute to the pathogenesis of OA，which probably lead to the degradation and destruction of the pericellular matrix.
【Key words】 osteoarthropathy；type-Ⅹ collagen；articular cartilage；matrix
关节表面透明软骨的基质成分和生物学功能的维持，对脊椎动物的正常运动至关重要。而关节软骨发生退行性病变，致使OA的发生和发展，在全世界范围内影响着越来越多老年人的生活质量。在OA患者的关节软骨中，各种重要的基质组成发生显著的变化，由胶原和蛋白聚糖所组成的网络状结构亦随之而发生变构，丧失原有的生理功能。本实验通过对OA关节软骨中Ⅹ型胶原代谢状况的研究，希望可以为OA的临床诊断和治疗提供有益的参考依据。
1 材料与方法
1.1 关节软骨标本 5例正常对照和15例OA关节软骨均取自本院骨科行关节置换的OA患者。由于软骨基质的代谢过程不仅与OA的病程相关，还与个体的老化程度相关，因此选取病人例数最多的50～60岁这一年龄段。正常对照组也处于这一年龄段之间。各组标本取下后，经生理盐水冲洗，去除碎屑，置于-70℃冻存待用。
1.2 RNA抽提 将-20℃冻存的软骨组织块剪碎，研磨成糜状，Trizol（GIBCO BRL） 4℃，浸泡裂解过夜。当软骨组织完全溶解于Trizol中，呈乳状悬液后，按照常规方法抽提总RNA。
1.3 RT-PCR 将mRNA逆转录为cDNA（2μl RNA/20μl 体系，TaKaRa AMV Reverse Transcriptase XL）。2μl cDNA/20μl 体系进行PCR反应（TaKaRa Taq）。Ⅹ型胶原引物序列如下：正义链 5'-TGGGTAGGCCTGTATAAAGAACGG -3'；反义链5'-CATGGGAGCCACTAGGAATCCTGAGA -3'。反应的退火温度为55℃，产物的片段长度为210bp。
1.4 Northern杂交 总RNA样本20μg左右，在含有2.2mol/L 甲醛的1%琼脂糖凝胶中50V电泳6h左右。电泳完毕后，凝胶用DEPC水稍加淋洗，毛细洗脱法将RNA样品转移至尼龙膜，具体步骤按照分子克隆实验指南进行。尼龙膜以0.12J/cm2紫外线照射交联。取100～200ng探针片段，以32P标记，加入到10ml杂交液（CLONTECH）中，与尼龙膜68℃杂交过夜。次日，将尼龙膜置于100ml 1×SSC（20×SSC:3 mol/L NaCl，0.3 mol/L柠檬酸钠）/0.1% SDS中，42℃漂洗20min；再用100ml 0.2×SSC/0.1% SDS稍加漂洗。最后，磷屏显影，进行光密度分析。
1.5 Western杂交 将各软骨组织块剪碎，研磨成糜状，按50g/L蛋白裂解液的比例充分裂解。取各蛋白裂解液25μl，进行SDS-PAGE蛋白变性电泳，具体步骤参见分子克隆实验指南。
1.6 实验结果的统计学分析 各例样本至少检测3次；以ddH2O作为空白对照。采用SPSS 10.0软件进行分析。
2 结果
2.1 OA软骨的组织学特征 与正常对照关节软骨相比，病变软骨无光泽，呈淡黄色，表面粗糙，有大小不一的软骨碎裂剥脱，软骨下骨暴露，部分有溃疡形成。HE染色显示软骨基质纤维变性，部分细胞增殖活跃，存在簇聚现象。
2.2 RT-PCR检测Ⅹ型胶原表达 结果显示：OA患者的关节软骨细胞中Ⅹ型胶原在mRNA水平有显著升高，对RT-PCR的结果进行光密度分析，可以发现OA组的collagen-Ⅹ/β-actin的比值与正常对照组差异有显著性（P＜0.05）。
2.3 Northern杂交检测Ⅹ型胶原表达 结果显示：在OA组的关节软骨中Ⅹ型胶原的表达水平非常显著地高于正常对照组（P＜0.01），达到2.4049倍。
2.4 Western杂交在蛋白水平检测Ⅹ型胶原的含量 结果显示：OA患者的关节软骨基质中Ⅹ型胶原的含量显著升高（P＜0.01）。
2.5 mRNA和蛋白水平Ⅹ型胶原表达水平改变相关性分析 将各例OA患者的RT-PCR、Northern杂交与Western杂交结果，通过Pearson相关性分析，最终显示mRNA与蛋白水平的Ⅹ型胶原的表达水平的变动并不具有显著的相关性（P＞0.05）。
3 讨论
在正常关节的透明软骨中，由Ⅱ、Ⅸ和Ⅺ型各种不同的胶原纤维交联成的网络结构提供其必要的组织强度和顺应力［1］。Ⅹ型胶原是一种短链的非纤维性胶原，由三条相同的α1链组成三聚体，正常存在于软骨化骨中心及骨骺软骨生长板内的软骨细胞周围的基质中。Ⅹ型胶原可以形成栅格状的结构［2］，并与Ⅱ型胶原纤维发生联系，影响关节软骨的结构和强度［3］。
在OA患者的关节软骨中，软骨细胞自身的生长和增殖，及其基质的合成和代谢均出现紊乱［4］。根据本实验的结果，无论是在mRNA水平还是在蛋白水平，OA患者的关节软骨中Ⅹ型胶原的表达都要显著的高于正常对照组。在OA患者的关节腔中，由于炎症反应的进行，存在各种细胞因子，如IL-1β和TNF-α等［5］。当周围的生化条件发生改变，OA的关节软骨中，软骨细胞会失去正常表型，转化成肥大软骨细胞，不再表达Ⅱ型胶原，转而大量合成Ⅹ型胶原。在很多的临床病例中，都发现OA的发生往往伴随着Ⅹ型胶原的合成和沉积，并且随OA的病变过程，Ⅹ型胶原的阳性表达会扩展向软骨表面的纤维化区和骨赘形成的区域［6］。
经本实验的统计学分析，又发现在OA的关节软骨中，Ⅹ型胶原在mRNA和蛋白水平表达的变化情况并没有显著的相关性。这种不一致性，笔者认为主要是因为OA关节软骨中细胞凋亡与基质降解的不同步性造成的。当细胞发生凋亡时，既没有mRNA的合成，又在酶的催化作用下使原有的mRNA等生物大分子迅速降解。但与此同时，胞外的Ⅹ型胶原蛋白并不会像mRNA那样急速的分解，因而，在各个具体的OA关节软骨中，Ⅹ型胶原的mRNA和蛋白水平表达的状况并不是同步的。
本实验的Northern杂交与RT-PCR结果的差别提示，Northern杂交是一种更为精确和可信的半定量检测方法。由于RT-PCR历经了2步酶反应，其间的平台效应可能会影响到实验结果的准确性［7］。
在临床中，OA一般常见于老年人群，是一种较为普遍的老年性疾病。在老化过程中，软骨细胞合成Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原的能力逐渐变化，令基质中Ⅱ型/Ⅹ型胶原的比例不断降低。当OA发生后，半月板显示有相当程度的崩解与中心的骨化，四周的软骨基质强烈表达Ⅹ型胶原，且由于结构松散易被水解。而软骨中的胶原代谢率极低［8］，当外周的基质被水解后，软骨细胞直接与炎症反应中的各种细胞因子接触，大量凋亡，更加无法补偿被破坏的胞外基质，从而使OA的病症进一步恶化。
【参考文献】
1 Heinegard D，Oldberg A. Structure and biology of cartilage and bone noncollagenous macromolecules. FASEB J，1989，3:2042-2051.
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4 Metsaranta M，Kujala UM，Pelliniemi L，et al. Evidence for insufficient chondrocytic differentiation during repair of full-thickness defects of articular cartilage. Matrix Biol，1996，15:39-47.
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6 Hoyland JA，Thomas JT，Donn R，et al. Distribution of type Ⅹ collagen mRNA in normal and osteoarthritic human cartilage. Bone Miner，1991，15:151-163.
7 Foley KP，Leonard MW，Engel JD. Quantitation of RNA using the polymerase chain reaction. Trends Genet，1993，9:380-385.
8 Shapiro K，Koide S，Glimcher MJ. Cell origin and differentiation in the repair of full-thickness defects of articular cartilage. J Bone Joint Surg Am，1993，75-A:532-533.
作者单位： 200062 上海，上海市普陀区中心医院骨科
（编辑：齐 永）