点击显示 收起
【摘要】 目的 研究高危型HPV在宫颈癌及其癌前病变（CIN）中的感染情况，并探讨HPV16E6基因的含量与CIN进展的关系。方法 用触减PCR法检测70例CIN、19例宫颈癌及57例慢性宫颈炎组织中高危型HPV（包括HPV16、18、31、33、52和58）的感染情况，并以同管扩增PCR法检测HPV16E6基因的含量。结果 （1）在146例宫颈标本中，高危型HPV阳性标本71例（占48.6%），且阳性率随CIN加重而升高;CINⅡ/Ⅲ组及宫颈癌组的高危型HPV阳性率显著高于慢性宫颈炎组及CINⅠ组（P<0.01）。（2）在71例高危型HPV阳性标本中，共筛选出34例HPV16阳性（占47.9%）。HPV16E6基因的含量随CIN加重而增加，差异有显著性（r s =0.78，P<0.01）;CINⅡ/Ⅲ组及宫颈癌组中HPV16E6基因的含量显著高于慢性宫颈炎组及CINⅠ组（P<0.01）。结论 （1）高危型HPV在CINⅡ/Ⅲ及宫颈癌中有较高感染率，且感染率与宫颈病变严重程度有关。（2）PV16E6基因的含量与CIN的进展有关，定量检测HPV16DNA的含量可能作为判断CIN严重程度及其转归的参考指标。
关键词 人乳头瘤病毒 宫颈癌 宫颈上皮内瘤变 癌基因 聚合酶链反应
Detection and evaluation of high-risk human papillomavirus in cervical cancer and precancerous lesions by semiquantitative polymerase chain reaction
Xu Xiaoming，Liu Fengying，Li Ting，et al.
Department of Gynecology，the Second XiangYa Hospital， Central South University，Changsha410011.
【Abstract】 Objective The aims of this study were（1）to investigate the distribution of the most prevalent high-risk human papillomavirus（HR-HPV）types in cervical cancer and precancerous lesions（CIN）and（2）to eˉvaluate the relationship between the quantities of HPV16E6gene in cervical tissues and the development of cervical intraepithelial neoplasia（CIN）.Methods The prevalence of HR-HPV（including HPV type16、18、31、33、52and58）among70cases of CIN，19cases of cervical cancer and57cases of chronic cervicitis was determined by touchdown polymerase chain reaction（PCR）.Then，we used a semiquantitative PCR protocol to measure the quantiˉties of E6gene in HPV16positive samples.Results The overall HR-HPV positive rate among146cases was48.6%（71/146）.The positive rate of HR-HPV increased statistically significantly with the severity of CIN.The posiˉtive rate of CIN II/III or cervical cancer was significantly higher than that of chronic cervicitis or CIN I（P<0.01）.Of these71cases，34（47.9%）were positive for HPV16.Semiquantitative evaluation of the results showed that the quantities of HPV16E6gene increased as CIN progress toward cervical cancer.They had positive rank correlation（r s =0.78，P<0.01）.The quantities of HPV16E6gene were significantly different between CIN II/III or cervical canˉcer and chronic cervicitis or CIN I（P<0.01）.Conclusion There was a high prevalence of HR-HPV in CIN II/III and cervical cancer，which may be associated with the severity of cervical lesions.The quantities of HPV16E6gene appear to be associated with an increased risk of developing cervical cancer.Quantification of HPV16DNA may be useful to identify the severity of CIN and predict the outcome of CIN.
Key words human papillomavirus cervical cancer cervical intraepithelial neoplasia oncogene polymerase chain reaction
高危型HPV感染在宫颈癌及其癌前病变（CIN）发病中的重要作用已基本得到了公认。CIN具有可逆性及进展性，其自然消失或进展为癌与病变的范围、程度、HPV感染类型及持续时间等有关，故早期诊断CIN、正确预测CIN转归方向有其重要意义。本研究通过包含最常见数个高危型HPV E6和E7的通用引物对宫颈癌及其癌前病变中高危型HPV的感染情况进行筛查;并通过半定量检测HPV16E6致癌基因的含量来判断其与CIN严重程度及CIN转归是否有关。
1 资料与方法
1.1 研究对象和分组 选取2003年3月～2004年2月在中南大学湘雅二医院及湖南省妇幼保健院行阴道镜下宫颈活检、宫颈电圈切除术（LEEP）或子宫切除术后的宫颈标本共146例作为本研究对象。全部标本都具有病理组织学检查结果，根据病检结果将宫颈病变分为慢性宫颈炎组57例、CINⅠ组30例、CINⅡ组20例、CINⅢ（包括原位癌）组20例及宫颈浸润癌组19例。患者年龄为20～65岁，平均年龄39.70±9.32岁。孕次0～8次，平均3.21±1.68次。产次0～4次，平均1.52±0.79次。
1.2 实验方法
1.2.1 标本的收集和处理 每位患者手术或活检时留取小部分宫颈新鲜组织，立即投入-70℃液氮罐中保存备用，余组织全部送病理组织学检查，取病检确诊后的146例宫颈标本行高危型HPV-PCR法检测。将宫颈组织碾碎，加入裂解液2.0ml、20%SDS0.5ml、20mg/ml蛋白酶K25μl、混匀，37℃水浴消化过夜后，酚/氯仿法常规抽提DNA，-20℃保存备用。
1.2.2 主要实验步骤 （1）高危型HPV-触减PCR（touchˉdown PCR）反应:对146例宫颈标本进行定性检测，按参考文献 ［1］设计的引物A、B在HPV E6-E7基因高保守区内，为HPV16、18、31、33、52及58等6种高危型HPV所共用，见表1。
表1 不同PCR反应引物序列（略）
反应体系内含10×Buffer（100mmol/L KCl;100mmol/L Tris·HCl，pH8.3），1.5mmol/L MgCl 2 ，dNTP0.2mmol/L，TaqDˉNA聚合酶1u，引物A、B各l00pmol，模板DNA l00ng。反应条件为先95℃5min;然后95℃40s，56℃35s，72℃40s，循环10次;再94℃35s，53℃28s，72℃30s，循环20次;最后72℃10min。（2）HPV16E6-PCR反应:选取高危型HPV阳性标本，行HPV16的PCR反应。自行设计的引物C、D对应于HPV16基因序列165368bp的E6编码区（见表1）。反应体系内除引物C、D各l00pmol外，余同上。反应条件为95℃5min;再95℃40s，56℃35s，72℃50s，循环26次;最后72℃10min。（3）HPV16E6同管扩增PCR反应:选取HPV16阳性标本，再用HPV16E6引物C、D和β-actin引物E、F同管行PCR扩增，引物E、F对应于β-actin基因序列136484bp编码区（见表1）。反应体系内除引物C、D各l00pmol，引物E、F各33pmol外，余同上。反应条件为95℃5min;再95℃40s，56℃35s，72℃50s，循环26次;最后72℃10min。（4）每次PCR反应皆以正常胎盘组织DNA代替模板DNA为阴性对照，以生理盐水代替模板DNA为空白对照，同时行PCR扩增。
1.3 结果判断 取2.5μl扩增产物于6%PAGE胶中电泳，与DNA Marker（100bp ladder）对照，在230270bp间出现阳性条带，为高危型HPV阳性;出现204bp阳性条带，为HPV16 阳性;出现349bp阳性条带，为β-actin阳性。于紫外线灯下扫胶、照相，然后用gen genius软件分析结果（见附图1～4）。
1.4 统计学处理 用SPSS11.0统计软件处理，采用了X 2 检验、方差分析（SNK-q检验）和Spearman等级相关分析，P<0.05为显著性检验水平。
2 结果
2.1 高危型HPV在CIN、宫颈癌及宫颈炎中的感染情况在146例宫颈标本中检测出高危型HPV阳性标本71例（48.6%）;高危型HPV阳性率随CIN加重而升高，见表2。X 2 检验显示，CINⅡ/Ⅲ组及宫颈癌组的高危型HPV阳性率明显高于慢性宫颈炎组及CINⅠ组，差异有极显著性（P<0.01）。
表2 CIN、宫颈癌及宫颈炎中HPV的感染情况（略）
CINⅠ组与慢性宫颈炎组间也有显著差异（P<0.05）;而宫颈癌组与CINⅡ/Ⅲ组、以及CINⅡ组与CINⅢ组的差异均无显著性（P>0.05）。见表3。
表3 各组之间HR-HPV感染情况的比较各组之间比较（略）
2.2 HPV16在CIN、宫颈癌及宫颈炎中的感染情况 在71例高危型HPV阳性的宫颈标本中，筛选出34例HPV16阳性标本（占47.9%），HPV16为主要致病型。HPV16阳性率随CIN的加重也趋于升高（见表2）。
2.3 CIN、宫颈癌及宫颈炎组织中HPV16E6基因的相对含量对筛选出的34例HPV16阳性标本，用HPV16E6基因的引物与内参照基因β-actin的引物一起扩增，扩增后都出现204bp和349bp两条带。用gen genius软件分析，34例HPV16阳性标本目的基因与内参照基因扩增产物的比值在.046～3.319之间，CIN、宫颈癌及慢性宫颈炎组织中E6基因的相对含量平均数及标准差详见表4。
用Spearman等级相关分析HPV16E6基因的相对含量与CIN严重程度的关系，r s =0.78，P<0.01，二者呈显著正相关，E6含量随CIN加重而呈上升趋势，提示HPV16E6含量与CIN的进展有关。方差分析（SNK-q检验）表明，CINⅡ/Ⅲ组及宫颈癌组的HPV16E6基因含量高于慢性宫颈炎组及CINⅠ组，差异有极显著性（P<0.01）;宫颈癌组与CINⅡ/Ⅲ组、CINⅡ组与CINⅢ组、以及CINⅠ组与慢性宫颈炎组的差异均无显著性（P>0.05）。（见表5）。
表4 CIN、宫颈癌及宫颈炎中HPV16E6基因的相对含量（略）
表5 各组之间HPV16E6基因相对含量的比较（略）
3 讨论
3.1 高危型HPV与宫颈癌及CIN的关系 高危型HPV感染导致宫颈癌及CIN已明确。有研究显示HPV与所有确诊的CINⅢ和宫颈癌都有关系 ［2］ ，而持续性HPV感染与CIN病变进展的关系更为密切，故HPV检测、尤其高危型HPV检测在预测CIN的自然转归，以及治疗后的随诊上都有重要的作用 ［3］ 。最近统计，在宫颈鳞癌HPV阳性患者中，最常见58型的HPV感染者约占其感染总数的90%ˉ95% ［4］ 。在本研究中，设计的高危型HPV引物在HPV E6-E7基因高保守区内，为最常见的6种高危型HPV所通用;且与常见的低危型HPV6、11等无交叉阳性反应 ［1］ 。并在实验中参照了Don等 ［5］ 的文献，应用触减PCR法进行检测，极大提高了目的基因的特异性及扩增产量。本研究发现高危型HPV总阳性率为48.6%（71/146），且阳性率随CIN加重而升高，并存在显著性差异，进一步证实了高危型HPV与宫颈癌及CIN的发生有关。
HPV16被认为是最有可能成为持续性感染的高危型HPV型别之一，而E6和E7为HPV16导致肿瘤发生的两种主要癌基因蛋白。故我们选择最常见、且致病力较强的HPV16型作为进一步研究的对象，将引物设计在E6基因序列内，对高危型HPV阳性标本进行筛查，HPV16感染占47.9%（34/71），再次证实HPV16为主要致病型。
3.2 半定量检测HPV16E6基因的意义 HPV感染与CIN病变均具有暂时性、一过性的特点。Chan等 ［6］ 在研究93例CINⅡ/Ⅲ的自然转归时发现，无HPV感染者是HPV持续感染者逆转的4倍，及时预测CIN转归方向，对于临床正确、适度的处理CIN无疑是至关重要的。研究发现，高危型HPV DNA水平与CIN病变进展密切相关 ［7］ ，通过检测高危型HPV E6基因的含量，可以帮助研究HPV致癌基因的致 癌机制。定量PCR对HPV的研究目前尚只有少数报道，最新的实时定量PCR因为仪器昂贵应用受到限制，而竞争性PCR和荧光定量PCR（FQ-PCR）等半定量PCR法的应用渐普及。本研究应用同管扩增PCR法分析了各级CIN及宫颈癌中HPV16E6基因的相对含量，发现E6基因含量与CIN严重程度呈显著正相关，证实E6含量随CIN加重而呈上升趋势，与马彩玲等 ［8］ 的研究结果相类似。比较CIN、宫颈癌及宫颈炎各组，发现宫颈癌及CINⅡ/Ⅲ组织中的HPV16E6基因的含量显著高于慢性宫颈炎及CINⅠ，由此可见伴有HPV16感染的慢性宫颈炎及CINⅠ在可能转变为癌的过程中伴随着HPV16E6基因含量的增高，这从分子水平上进一步证实了E6基因与致癌密切关系。
本实验以目的基因与β-actin扩增产物的比值作为目的基因的相对含量，不能进行绝对定量。但相较于其他半定量PCR法，同管扩增PCR法具有一定的灵敏性及准确性，不需要特定的仪器，且经济有效、简便易行，适于临床开展运用。本试验结果提示我们同管扩增半定量PCR法检测宫颈组织中HPV DNA含量是可行的，HPV16E6基因的含量与CIN的进展有关，定量检测HPV16DNA的含量可能作为判断CIN严重程度及其转归的参考指标。（本文图片见封三）
参考文献
1 Fujinaga Y，Shimada M，Okazawa K，et al.Simultaneous detection and typing of genital human papillomavirus DNA using the polymerase chain reaction.J Gen Virol，1991，72:1039-1044.
2 Bohmer G，van den Brule AJ，Brummer O，et al.No confirmed case of human papillomavirus DNA-negative cervical intraepithelial neoplasia grade3or invasive primary cancer of the uterine cervix among511paˉtients.Am J Obstet Gynecol，2003
，189（1）:118-20.
3 Houfflin D V，Collinet P，Vinatier D，et al.Value of human papilloˉmavirus testing after cognization by loop electrosurgical excision for high-grade squamous intraepithelial lesions.Gynecol Oncol，2003，90（3）:587-592.
4 Munoz N，Bosch FX，Sanjose S，et al.Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer.N Engl J Med，2003，348（6）:518-527.
5 Don RH，Cox PT，Wainwright BJ，et al.’Touchdown’PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.Nucleic Acids Res，1991，19（14）:4008.
6 Chan JK，Monk BJ，Brewer C，et al.HPV infection and number of lifeˉtime sexual partners are strong predictors for’natural’regression of CIN2and3.Br J Cancer，2003，89（6）:1062-1066.
7 Josefsson AM，Magnusson PK，Ylitalo N，et al.Viral load of human paˉpilloma virus16as a determinant for development of cervical carcinoma in situ:a nested case-control study.Lancet，2000，355（9222）:2189-2193.
8 马彩玲，李轶杰，张富春，等.应用荧光定量聚合酶链方法检测宫颈组织中人乳头瘤病毒16E6基因.中华医学杂志，2004，84（6）:469-473.
（收稿日期:2004-06-10） （编辑海 天）
作者单位:410011长沙中南大学湘雅二医院妇科
410008长沙中国医学遗传学国家重点实验室