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【摘要】 目的 研究牛脾脏提取物的体内抗肿瘤活性。方法 采用超滤和离心技术制备脾脏提取物，用移植型S180荷瘤小鼠做动物模型，腹腔注射脾提取物，观察小鼠存活期，并计算抑瘤率。结果 脾脏提取物显著增加荷S180昆明小鼠的存活率，并抑制肿瘤的生长，治疗第15天最高抑瘤率达到61%。结论 脾脏提取物是一种分子量小且安全有效的抗肿瘤活性物质。
关键词 脾脏 低分子抑瘤物 抗肿瘤作用
The antitumor effects of the extract from spleen in vivo
Xiao Jianying，Li Hong，Yu Hongru，et al.
Dept of Biochemistry，Jinzhou Medical College，Liaoning121001.
【Abstract】 Objective To study the antitumor activity of the extract from bovine spleen in vivo.Methods The spleen extract was prepared with technologies of ultrafiltration and centrifugation.S180-bearing mice act as aniˉmal models th
at were treated with intraperitoneal injection of the extract，and survival time of mice was observed and inhibition rate was calculated.Results The spleen extract significantly prolonged the survival period of the S180-bearing Kunming mice and inhibited the growth of S180-cells.Conclusion The spleen extract is a safe and effecˉtive and low molecular weight tumor suppressor. Key words spleen low molecular weight tumor suppressor antitumor effect
肿瘤是细胞异常增生性疾病，严重危及人类的生命与健康。长期以来，人们一直在寻找安全有效的抗肿瘤药物，由于动物组织含有多种活体产生的天然抗癌物质，毒性很低，因而倍受人们的关注。从动物组织提取的低分子多肽类物质用于抗肿瘤研究已有许多报道 ［1，2］，但关于脾肽的研究很少。众所周知，脾脏是机体重要的免疫器官，含有多种生物活性物质，但其结构、理化特性及生物学功能尚有待于深入研究。本文旨在探讨脾脏提取物的抗肿瘤活性，为其进一步开发和应用提供实验依据。
1 资料与方法
1.1 实验动物及药品仪器 昆明小鼠，雄性，体重20±2g，由锦州医学院实验动物中心提供;环磷酰胺为济南制药厂产品;中空纤维柱北京宣武超滤设备厂生产;UV1601紫外分光光度计日本岛津公司产品。
1.2 瘤株 S180由昆明小鼠腹水传代。小鼠腹腔接种1.0×10 5 个S180细胞后第10天，无菌条件下抽取腹水，用RPMI1640培养液稀释后计数，腹腔接种传代。
1.3 脾脏提取物的制备 取健康牛脾经消毒液消毒，用无菌生理盐水洗净，剥离被膜和结缔组织、称重，以生理盐水按20%（w/v）比例制成匀浆;-40℃反复冻融2次，使细胞充分裂解，4℃、10000r/min、离心30min;取上清依次用分子量为50kD和10kD的中空纤维柱超滤，收集分子量小于10kD的滤液，并用0.20μm的滤膜过滤除菌，即得到分子量小于10kD的脾脏提取物，-40℃保存备用。
1.4 提取物的成分分析 ①蛋白质定性检查:20%磺基水杨酸试验;②氨基酸定性检查:茚三酮反应;③多肽定性检查:双缩脲法;④多肽含量测定:采用《中国生物制品规程》方法;⑤紫外分光光度计分析:用紫外分光光度计扫描测定OD 260 及OD 280 值。
1.5 体内抑瘤实验 取昆明小鼠50只，无菌条件下每只右腋皮下接种0.2ml S180细胞悬液（5×10 5 /ml），12h后将小鼠随机分为5组，每组10只。治疗一组、治疗二组、治疗三组分别腹腔注射分子量小于10kD的脾脏提取物40、60、80mg/kg，空白对照组以25ml/kg的剂量腹腔注射生理盐水，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺（CTX）25mg/kg，各组均每天注射1次，连续注射14天。用药过程中注意观察小鼠生长状态及存活率，各组存活小鼠于第15天处死，称鼠体重，剥离肿瘤称瘤重，并计算抑瘤率。抑瘤率（%）=［1-（治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重）］×100%
1.6 统计学处理 用药组与空白对照组之间的显著性比较采用t检验。
2 结果
2.1 脾脏提取物的理化特性 该提取物经分子量为10kD的中空纤维柱超滤后，以20%的磺基水杨酸检测蛋白反应呈阴性;茚三酮反应呈阳性;双缩脲反应呈阳性;多肽含量测定终浓度在5mg/ml以上;紫外分光光度计测得OD 260 /OD 280 比值为0.74。以上分析结果表明脾脏提取物是以低分子多肽成分为主的混合物，含有少量核酸和氨基酸。
2.2 脾脏提取物对荷S180昆明小鼠存活率的影响 空白对照组小鼠接种S180后第13天开始死亡，至第15天处死前存活5只，存活率为50%;阳性对照组与治疗一组第14天开始死亡，最后存活率分别为70%和80%;治疗二组和治疗三组存活率均为100%。与空白对照组相比，各组存活率明显增加（P<0.01），见表1。表1 脾脏提取物对荷S180昆明小鼠存活率的影响（略）注:与空白对照组比较， ˇˇ P<0.01。
2.3 脾脏提取物对荷S180昆明小鼠肿瘤生长的抑制作用 如表2所示，与空白对照组相比，阳性对照组小鼠体重增加有显著的抑制作用，说明CTX有明显的毒性;而脾提取物治疗各组几乎不影响鼠的正常生长，小鼠体重的增加与 空白对照组无显著差别。CTX对小鼠S180瘤细胞的生长抑制显著，抑瘤率为83%，3个剂量的脾提取物对瘤体生长也有明显的抑制作用，且抑瘤率随着用药剂量的增加而增加，最高抑瘤率达61%。表2 脾脏提取物对荷S180昆明小鼠肿瘤生长的影响（略）注:与空白对照组比较， P<0.01， ˇ P<0.05， △ P>0.05。
3 讨论
许多研究证实生物体内的多种组织细胞和体液中广泛存在着低分子抑瘤物，可能是组织细胞特定合成的或物质代谢的中间产物，其结构和理化特性不一，但在生物体内清除恶性转化细胞、防止肿瘤发生与发展的过程中起着重要的作用 ［3，4］ 。本研究采用超滤和离心技术从健康牛脾中提纯分子量小于10kD的物质，分析表明其有效成分是以多肽为主的混合物。体内抑瘤实验证实该提取物不但增加荷S180小鼠的存活率，而且对瘤细胞的生长速度有明显的抑制作用，并呈现剂量依赖性，即抑瘤率随着用药剂量的增加而增加，本实验最大抑瘤率达到61%。虽然低于环磷酰胺的抑瘤率，但因其不影响小鼠的正常生长，毒性很低，所以 是一种安全有效的抑瘤物，关于其确切的结构和抑瘤机制有待于进一步研究。
参考文献
1 王秀芳，刘福英，徐增年，等.大鼠不同组织提取物对荷S180小鼠体内抑瘤作用.实验动物科学与管理，1998，15（2）:25.
2 梁安民，谢裕安，罗小玲，等.胎牛肝细胞低分子天然抑瘤物的生物学特性及抗肿瘤作用.中国肿瘤，2002，11（6）:369.
3 麻亚锋，陈钧辉，张冬梅，等.人尿提取物抗肿瘤活性研究.中国药理学通报，2004，20（1）:69.
4 王喜安，肖正达，金冠球，等.胎脑低分子抑瘤物对白血病细胞作用的研究.海军医学杂志，2000，21（4）:301.
基金项目:辽宁省教育厅资助项目（编号9805211047）
作者单位: 21001辽宁省锦州医学院生化教研室
21001辽宁省锦州医学院实验动物中心
辽宁省锦州奥鸿药业
（收稿日期:2004-06-15）
（编辑毅 文）