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【摘要】 目的 旨在探讨血管内皮生长因子（VEGF）在肺癌组织中的表达及其临床价值以及VEGF与肿瘤生长、转移及预后的关系。方法 对38例肺癌组织以免疫组织化学法研究VEGF在肿瘤组织的胞内分布及其表达;同时以ELISA法测定临床上肺癌、良性肺病患者及正常对照血清中的VEGF水平。结果 肺癌组织中VEGF位于胞质和胞膜，呈棕黄色颗粒状过度表达，Ⅲ期、Ⅳ期肺癌和伴远处转移者阳性率为90%，肺癌患者血清中VEGF水平显著高于正常对照（P<0.01），但在良恶性肺病组间未见明显差异，经抗感染药物治疗后，良性肺病患者血清VEGF水平明显下降。结论 资料提示肺癌发生和发展过程中VEGF呈过度表达，检测患者血清VEGF可以作为肺癌诊断和预后的有用指标。
关键词 血管内皮生长因子 肺癌 免疫组化 酶联免疫吸附分析 诊断
Abnormal expression of vascular endothelial growth factor and
its diagnosis and prognosis values in patients with lung cancer
Feng Jian，Wu Xinhua，Ni Songshi，et al.
Affiliated Hospital of Nantong Medical College，Jiangsu226001.
【Abstract】 Objective To explore changes and clinical values of vascular endothelial growth factor（VEGF）in diagnosis and prognosis of patients with lung cancers.Methods The VEGF cellular distributions and expression in38specimens of patients with lung cancer were investigated with immunohistochemistry assay.The levels of VEGF in sera of patients with lung cancer，benign lung diseases and healthy controls were detected through ELISA method.Results The VEGF positive stain
was76%in38cases of lung cancer specimens.The89%rate of VEGF stain was found for clinical stageⅢcases and92%for stageⅣlung cancers.The significantly higher expression of VEGF was eviˉdenced in patients with lymph node metastasis（84%），distant metastasis（90%），and lung cancers with lower histologˉical differentiation（89%），respectively.No significant difference of serum VEGF levels was detected between cases with lung cancer and patients with benign diseases（mainly inflammauory disease）.However，the VEGF level of cases with benign diseases was decreased significantly after patients with anti-inflammation medication.Conclusion The present data suggested that the expression of VEGF has a significant correlation among growth，invasion and lymphonˉode metastasis.VEGF may be an independent predictor of prognosis.The level of serum VEGF in patients with lung cancer may be a useful indicator for tumor angiogenesis and metastasis.
Key words vascular endithelial growth factor lung cancer immunohistochemistry ELISA diagnosis
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）直接或间接地刺激宿主的免疫细胞或基质细胞，促进内皮细胞的增殖与迁移，最终导致新生血管形成 ［1］ ，肺癌生长和发展受组织中多种生长因子的调节，如纤维母细胞生长因子（FGF）、转化生长因子（TGF）、血小板源性生长因子（PDGF）和血管内皮生长因子（VEGF）等，其中VEGF被认为是促进血管形成的主要因素 ［2］ 。它参与了肺癌营养血管的再生
、肿瘤的生长和转移，与预后密切相关 ［3，4］ 。本研究通过对肺癌组织中VEGF进行免疫组化胞内定位，并以ELISA法对肺癌、良性肺病患者及正常对照血清中的VEGF进行定量分析，以探讨VEGF在肺癌发生、发展中的作用，为肺癌的诊断及预后提供依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象 收集自2000年7月～2001年5月间我院肺癌手术中新鲜肺癌组织标本，分别留取肺癌组织、癌旁组织（距癌灶边缘3cm）及远癌组织（距癌灶边缘5cm）各38份，其中男32例，女6例，年龄40～68岁。按肿瘤病理组织学分类，均为非小细胞肺癌，其中鳞癌24例，腺癌10例，鳞腺癌3例，细支气管肺泡癌1例。取部分肺癌组织做病理学检查（HE染色和地衣红染色），其余置于-80℃冰箱保存备用。
1.2 免疫组织化学方法 标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成4μm厚切片，经H-E染色组织学观察;免疫组织化学采用S-P法进行多克隆抗-VEGF抗体标记，DAB显色;用已知阳性标本做阳性对照，用PBS缓冲液代替-抗做阴性对照;结果判定:VEGF蛋白主要位于细胞浆中，细胞浆显示棕黄色颗粒为阳性。
1.3 肺病患者血清中VEGF水平检测 采用双抗体夹心ELISA法测定血清VEGF含量。本方法用抗人VEGF单抗包被于酶标板上，标准品或样品中的VEGF与单抗结合，加入生物素化的抗人VEGF，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的链霉菌抗生素蛋白与生物素结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加稀硫酸终止反应。在492nm处测A值，VEGF浓度与A值成正比，通过标准曲线求出标本中VEGF浓度。
1.4 统计学分析 采用F检验及卡方检验等方法进行统计学处理。
2 结果
2.1 肺癌组织中VEGF的免疫组织化学研究 免疫组化结果显示VEGF在肺癌组织中的表达与肿瘤分期、淋巴结转移、远处转移及肿瘤分化程度密切相关，定位于癌细胞胞质和胞膜上，呈棕黄色颗粒（图1）。癌细胞附近小血管内皮细胞有较高程度的VEGF表达，癌旁组织间质中小血管内皮细胞低或无VEGF表达，提示肺癌细胞过度表达VEGF，并且可结合到附近的小血管内皮细胞上。
图1 肺癌组织中VEGF表达与定位略
2.2 VEGF表达状态与临床的关系 VEGF在肺癌组织中阳性占76%，而癌旁组织中阳性仅21%，远癌组织中阳性为11%（P<0.01）;肿瘤PTNM分期与VEGF蛋白表达水平的关系:本文病例中VEGF阳性表达率分别为:Ⅰ期50%，Ⅱ期67%，Ⅲ期89%，Ⅳ期92%;VEGF阳性表达率随着肿瘤分期的进展而显著增加（P<0.01）;淋巴结转移与VEGF蛋白表达水平的关系:无淋巴结转移的原发病灶VEGF阳性表达率为62%，而有转移的VEGF阳性表达率为84%，两者之间差异存在显著性（P<0.05）;远处转移与VEGF蛋白表达水平的关系:本组病例中，28例无远处转移，其中有20例VEGF阳性表达;相反，10例远处转移病例中有9例VEGF表达阳性，二者之间差异存在显著性（P<0.05）;肿瘤的分化程度与VEGF表达水平的关系:如表1所示，低分化者肺癌的VEGF蛋白表达水平显著高于高、中分化者（P<0.05）。
2.3 血清VEGF水平对肺癌的诊断和鉴别价值 以酶联免疫吸附测定肺癌、良性肺病及健康人的血清VEGF水平，结果发现在肺癌和治疗前肺部良性疾病患者的血清VEGF水平分别为840±324pg/ml和732±359pg/ml，明显高于健康对照组的252±108pg/ml。但良性肺病患者经抗感染药物治疗后，血清VEGF水平在短期内迅速下降至正常水平280±108pg/ml（见表2）。
表1 肺癌VEGF表达与病理学分期、分化程度的关系略
表2 肺癌与良性肺病患者血清VEGF定量分析略
3 讨论
VEGF是一组促进血管内皮细胞分化的多功能细胞因子，它通过与其相应受体VEGF-R 1 ，VEGF-R 2 ，VEGF-R 3 ）结合而起作用 ［5，6］ 。它可高度特异性地诱导血管内皮细胞有丝分裂，直接刺激血管生成;也可诱导血管通透性增加，导致血管内大分子物质的漏出，有利于血管外基质的形成，为血管内皮细胞的增殖、血管的形成提供支架，辅助血管形成 ［7，8］ ;此外，VEGF对巨噬细胞的趋化作用诱导趋化来的巨噬细胞释放其本身的血管生成因子，间接促进血管生成 ［9］ 。本项研究结果提示，肺癌细胞附近小血管内皮细胞有较高程度的VEGF表达，癌旁组织间质中小血管内皮细胞低或无VEGF表达，提示肺癌细胞过度表达VEGF，并且可结合到附近的小血管内皮细胞上，在肿瘤血管形成中具有重要意义，进一步证实VEGF是重要的血管生成因子的观点。病理组织学发现，低分化肺癌VEGF表达率明显高于高分化肺癌，提示VEGF表达不仅与肿瘤组织血管生成有关，亦与肿瘤的恶性程度有关。Claffey ［10］ 等通过对脑膜瘤细胞系的研究发现，转染VEGF的肿瘤细胞VEGF表达越强，新生血管越丰富，其营养和氧的供应越充分，肿瘤的生长越快，瘤体相对较大，肺转移更多。抑制VEGF的表达和新生毛细血管的形成可抑制实验鼠的肺转移。而本研究中，有淋巴结转移的肿瘤VEGF表达明显高于无淋巴结转移组，也提示VEGF与肿瘤的生长转移的密切关系。肿瘤的新生血管决定着肿瘤从增生向恶化的转化，本研究可见随PTNM分期增加，肺癌VEGF表达率也相应增高，故推测肺癌VEGF表达与患者预后有关。
Kido等 ［11］ 以酶联免疫法测定并比较了70例肺癌（腺癌、鳞癌、大细胞癌、小细胞癌）和健康人的血浆VEGF的水平，发现肺癌患者的血浆VEGF水平为834±699pg/ml，明显高于健康对照组的264±129pg/ml，但血浆VEGF水平与组织学、疾病分期和远处转移无明显相关性。对SCLC患者血浆VEGF的测定表明，治疗前高水平的血浆VEGF（>527pg/ml）与较差的存活期关联、对化疗有反应（部分或完全）患者的血浆VEGF明显低于无反应的患者 ［12］ 。表明测定肺癌患者血浆中VEGF水平对判断患者的预后具有重要的价值，并具有一定的诊断价值。
VEGF在肺癌中的过度表达，为进一步了解临床上肺癌患者血清VEGF水平与肺癌的早期鉴别诊断的关系，本研究采用血清测定而非血浆测定，原因是血浆表达浓度低，不易测定，而血清测定结果较为准确。以酶联免疫吸附法测定并比较了肺癌、良性肺病和健康人的血清VEGF水平，发现在肺癌和治疗前良性肺病患者的血清VEGF水平明显高于健康对照组，可能是由于VEGF与感染过程中的部分炎性介质有关，导致VEGF水平升高。但经抗感染药物治疗后VEGF水平迅速下降至正常，而肺癌组则持续高表达。这一结果说明VEGF在NSCLC中有过度表达，并通过对微血管生长的刺激作用而对肿瘤的生长、转移起促进作用。
检测肺癌及良性肺病患者血清VEGF水平有助于肺癌的早 期诊断和鉴别诊断。
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作者单位:226001南通医学院附属医院呼吸科
（收稿日期:2004-10-20） （编辑青 山）