HPLC法测定无敌丹胶囊中淫羊藿苷的含量

【摘要】  目的 建立HPLC法测定无敌丹胶囊中淫羊藿苷的含量。方法 用SYMMETRY C18 （5μm，4.6mm×250mm）色谱柱，柱温：36℃，流动相：乙腈-水（26：74），流速：0.8ml/min，检测波长：270nm。结果 淫羊藿苷在0.04620～0.3696μg范围内与峰面积线性关系好，r=0.9999，平均回收率为97.8%，RSD为0.89%（n=5）。结论 本法测定简便，结果准确，重复性和分离度好，可用于无敌丹胶囊的质量控制。

【关键词】  HPLC;淫羊藿苷;无敌丹胶囊;含量测定

    【Abstract】  Objective  To establish a HPLC method for the determination of icariin in Wudidan  capsules. Methods  SYMMETRY C18 column （250mm×4.6mm, 5μm） was used with  a mobile phase of acetonitrile-water（26:74）. The flow rate was 0.8ml·min-1 and the detection wavelength was 270nm. Results  The linear range was at 0.04620～0.3696μg（ r=0.9999）. The average recovery of icariin was 97.8% with RSD0.89%（n=5）. Conclusion  The  method is simple, accurate and it can be used for tbe quality control of Wudidan capsules.

    【Key words】  HPLC; icariin; Wudidan capsule ; determination

    无敌丹胶囊为《卫生部药品标准中药成方制剂第二十册》收载的品种【1】，由黄芪、杜仲、续断、肉苁蓉、苏木、川芎、没药、淫羊藿等二十味中药组成，具有益气活血，滋补肝肾，祛风除湿，消肿止痛功效。用于气虚血瘀，肝肾不足引起的骨性关节炎（骨质增生，骨折）。原标准中无含量测定方法，方中淫羊藿为主要药味,其有效成分为淫羊藿苷。为能有效地控制药品质量，本研究用HPLC测定淫羊藿苷，建立质量控制标准。

　　1  仪器与试药Shimadzu HPLC色谱仪

　　（LC-20A Liquid Chromatograph, SIL-20A Auto Sampler,  SPD-M20A Diode Array Detector, CTO-10AS VP Column Oven）LC Solution 色谱工作站。水为I级纯化水，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。淫羊藿苷对照品购自中国药品生物制品检定所（批号：110737-200414）。无敌丹胶囊：云南无敌制药有限责任公司（批号：20071201，M平=0.4015g；批号：20060902，M平=0.3982g；规格：0.4g/粒）。

　　2  试验方法与结果

    2.1  色谱条件  色谱柱：SYMMETRY  C18 （5μm ，4.6mm×250mm），柱温：36℃，流动相：乙腈-水（26：74），流速：0.8ml/min，检测波长：270nm。

    2.2  溶液的制备

    2.2.1  对照品溶液的制备  精密称取置五氧化二磷减压干燥16h的淫羊藿苷对照品11.55mg，置50ml量瓶中，加70%乙醇溶解稀释至刻度,摇匀，取2.00ml置25ml量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度,摇匀,制成每1ml含淫羊藿苷18.48μg的溶液，备用。

    2.2.2  供试品溶液的制备  取本品10粒，混匀，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加70%乙醇10.00ml，密闭,称重，超声处理（功率250W，频率33kHz）40min，放冷，用70%乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液。

    2.2.3  阴性对照溶液的制备  取按无敌丹缺淫羊藿的处方制剂，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

    2.3  系统适用性试验  取备用对照品溶液再稀释一倍, 分别取对照品溶液稀释液、样品溶液、阴性对照溶液进样10μl，色谱图见图1。淫羊藿苷峰保留时间为23.397min，阴性对照色谱图在淫羊藿苷峰位置无干扰峰，样品中淫羊藿苷峰与其他组分分离完全，分离度为2.8，理论板数以淫羊藿苷峰计算为14047。

    图1  HPLC色谱图2.4  线性关系考察  精密吸取对照品溶液稀释液5、8、10、20、40μl，按上述色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，以进样量为横坐标，进行线性回归，得方程：Y=-2174.630+2769611X，r=0.9999，线性范围为0.04620～0.3696μg。

    2.5  精密度试验  取对照品溶液连续进样6次，每次10μl，峰面积积分值RSD=0.21%。

    2.6  重复性试验  取同一批号（20071201）样品6份，按供试品液制备方法制备，依法测定，结果淫羊藿苷含量RSD=1.4%，表明本法重复性好。

    2.7  稳定性试验  取同一样品溶液（20071201）在0、6、12、24h分别进样10μl，依法测定，淫羊藿苷峰面积RSD=2.7%，表明样品溶液在24h内稳定。

    2.8  加样回收试验  精密称取已知含量的样品中粉（20071201）0.25g共9份,分别置具塞锥形瓶中,3份为一组,各精密加入淫羊藿苷对照品备用溶液3.5、3.0、2.5ml，挥干，按样品测定方法测定含量，计算回收率，结果见表1。表1  回收率试验结果

    2.9  样品测定  取2批样品，按“2.2.2”项下方法制备样品溶液，依法测定淫羊藿苷的含量，结果见表2。表2  3批样品含量测定结果

    3  讨论

    3.1  考察流动相中乙腈对淫羊藿苷保留时间和分离度的影响，曾采用抗骨增生胶囊中测定淫羊藿苷的流动相乙腈-水（30：70）【2】，乙腈-水（28：72）、乙腈-水（26：74），结果表明乙腈量增大，保留时间提前，但分离效果差，与杂质峰无法分离，以乙腈-水（26：74）较合适。

    3.2  无敌丹处方中共有中药材二十味,其中还有没药树脂成分,曾经考虑到利用黄酮类化合物与聚酰胺柱有亲和力，先水洗洗去杂质，再乙醇洗得淫羊藿苷类的方法，可除去大部分杂质峰，但某些保留时间与淫羊藿苷接近、影响分离度的关键峰不能除去；同样，碱水提取后酸化，用正丁醇萃取，还是不能解决这个问题。而且操作步骤增加，影响含量的精确性【2】,因而用70%乙醇超声法提取,直接进样,通过控制流动相的比例,主峰的理论塔板数和分离度完全能达到《中国药典》（2005年版）的要求【3】。

    3.3  在实验过程中，曾采用稀乙醇、70%乙醇、50%甲醇、甲醇为提取溶剂，超声处理（功率250W，频率33kHz）30、40、60、90min【4】，滤过，取滤液，测定样品中淫羊藿苷峰面积，结果表明超声30、40、60、90min淫羊藿苷峰面积几乎无变化，且用70%乙醇提取40min测得含量最高。

【参考文献】
  1 卫生部药品标准.中药成方制剂第二十册.51.

2 国家药典委员会.中国药典，一部.北京：化学工业出版社，2005，228.

3 洪行球,黄燕芬.HPLC测定乳腺康颗粒剂中淫羊藿苷的含量.中成药,2004,26（2）:165-167.

4 刘莲英，郭耀武.HPLC法测定益肾灵胶囊中淫羊藿苷的含量.中国药品标准,2004,5（1）:42-43.

作者单位：417000 湖南娄底，娄底市药检所