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【摘要】 目的 建立高效液相色谱法（HPLC）测定苯巴比妥（PB）的血药浓度。 方法 色谱分离柱Eclipse XDB-C8（4.6mm×150mm,5μm），流动相为乙腈：水（25：75），流速1.0ml/min，紫外检测波长210nm，用乙醚提取，蒸干后用流动相复溶进样。 结果 苯巴比妥（PB）的保留时间为7.45min；最低检测浓度为5μg/ml；在5.0μg/ml浓度范围内线性良好（r=0.9993）；两者高、中、低3种浓度的平均回收率分别为71.49%、81.38%、77.39%（n=6）；日内RSD分别为5.32%、7.60%、5.42%（n=6），日间RSD分别为6.79%、6.75%、4.20%（n=6），日间和日内RSD均小于10%。 结论 该方法准确、快速、简便，灵敏度高，重现性好，可作为苯巴比妥血药浓度监测的常规方法。苯巴比妥血药浓度的监测在癫痫治疗中对调整剂量具有重要的临床指导意义。
【关键词】 苯巴比妥；高效液相色谱法；血药浓度
抗癫痫药物（antiepileptic drugs, AEDS）属控制症状类药物，癫痫患者需长期用药且对药物反应具有极大的个体差异性。大量的临床试验证明通过对AEDS的血药浓度监测［1，2］，合理调整用药剂量，能显著提高疗效并减少不良反应的发生。苯巴比妥为巴比妥酸的衍生物，具有镇静、催眠、抗惊厥、抗癫痫等作用，是临床最常用的有效抗癫痫、止惊厥药物。由于其抗癫痫、抗惊厥作用和毒性与血药浓度密切相关，而用药剂量与血药浓度的关系个体差异较大， 因此笔者建立高效液相色谱法测定苯巴比妥血药浓度的方法［3，4］，以便了解临床用药的合理性和为进一步促进临床合理用药提供客观依据。
1 仪器与试药
BIO-RAD高效液相色谱仪；BIO-RAD 1801 紫外检测仪；BIO-RAD Series 800 高效液相数据处理系统；苯巴比妥对照品；甲醇、乙醚为分析纯；水为重蒸馏水。
2 色谱条件
色谱柱：Eclipse XDB-C8 不锈钢柱 （4.6mm×150mm，5μm），加保护柱； 流动相：乙腈-水（25：75）；流速：1.0ml/min；波长：210nm；柱温：室温；进样量：20μl。
3 实验方法与结果
3．1 标准贮备液的配制 用移液枪精密量取苯巴比妥对照品0.1ml（0.1g/ml）置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得苯巴比妥（1mg/ml）标准贮备液，于4℃冰箱中保存备用。
3．2 样品预处理 取待测血清样品200μl置于10ml具塞试管中，加5ml乙醚，充分振摇3min，离心8min（4000r/min），静置5min。提取上清液4.5ml于尖底离心管中，于40±1℃水浴挥干，加100μl流动相复溶，取20μl进样。
3．3 色谱图 标准贮备液用甲醇稀释至50μg/ml，进样15μl，用上述色谱条件测得苯巴比妥的色谱图。结果显示苯巴比妥的保留时间为7.45min。用上述样品处理方法得到的血清中，同法测得苯巴比妥的保留时间相同，且出峰前后没有干扰，图谱清晰。见图1（苯巴比妥标准品20μg/ml的色谱图），图2（空白血清的色谱图）。
3．4 标准曲线的制备 取上述配置的苯巴比妥标准贮备液精密配置成含苯巴比妥为80、60、40、20、10、5μg/ml的血清标准液各6管。配置方法如下：首先配置含苯巴比妥80μg/ml的血清标准液，然后在该标准液的基础上用空白血清依次稀释至60、40μg/ml的血清标准液，再用40μg/ml的血清标准液稀释至20μg/ml的血清标准液，依次而下至5μg/ml的血清标准液。将上述血清标准液按样品预处理及色谱条件测定（见图3，浓度为20μg/ml的血清标准液色谱图），得到其峰面积。根据苯巴比妥的峰面积（Y）与其浓度（C）成正比关系，进行统计学处理，得回归方程：Y=9890.836×C－2771.671,r=0.9993 图3 浓度为20μg/ml的血清标准液色谱图
3．5 回收率试验 用空白血清配制成每毫升含苯巴比妥5、20、80μg/ml的样品各6个，按“样品预处理”操作测定，以所测得的峰面积与加入量的峰面积之比计算回收率，结果见表1。表1 苯巴比妥高、中、低三种浓度的平均回收率
3．6 精密度试验 用空白血清配制成每毫升含苯巴比妥5、20、80μg/ml的样品，按照“样品预处理”操作，进样20μl分析；每批样品同一天内重复测定6次，同批血样连续测定6天，结果代入回归方程求得浓度并计算精密度，结果见表2。表2 苯巴比妥高、中、低三种浓度的日内、日间精密度
3．7 稳定性试验 苯巴比妥血样于-20 ℃冰箱中贮存，相隔15天所测得的结果变化不大。
3．8 干扰试验 在此色谱条件下，苯巴比妥保留时间（tR）为7.45min，卡马西平的tR为13.61min，茶碱和丙羟茶碱的tR分别为1.70min和1.87min，苯妥英钠的tR为18.05min，而异戊巴比妥的tR为10.71min，对苯巴比妥的峰没有干扰。
4 方法的应用
测定的4例服用苯巴比妥的病人的结果如下（测定的色谱图见图4）：Ⅰ 男，年龄23岁，苯巴比妥血药浓度为33.03μg/ml；Ⅱ 男，年龄18岁，苯巴比妥血药浓度为11.81μg/ml；Ⅲ 男，年龄20岁，苯巴比妥血药浓度为19.94μg/ml；Ⅳ 男，年龄5岁，苯巴比妥血药浓度为9.42μg/ml。从这个结果可以看出有2例病人的血药浓度偏低，小于15μg/ml。而另2例病人的血药浓度处于正常的有效范围15～40μg/ml。所以，对于苯巴比妥这类有效浓度和中毒浓度比较接近，个体差异较大的药物，血药浓度的测定是十分必要的。
5 结论
本方法选用乙腈：水（25：75）为流动相，方便又不损伤设备，取样量小，回收率、精密度都较高，快速、简便、重现性好，可作为苯巴比妥血药浓度监测的常规方法。
6 讨论
在建立高效液相色谱法的方法学时，开始的色谱柱为C18的长柱（25cm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈：水（40：60），出峰时间（tR）为5.53min，由于出峰时间稍稍偏早，所以流动相比例换为乙腈：水（35：65），则其出峰时间为7.39min。之后，色谱柱由长柱换为C18的短柱（150mm×4.6mm，5μm），流动相改为乙腈：水（25：75），由于此时苯巴比妥的出峰时间在10min之后，调整流动相为（30：70），此时出峰时间为7.58min。苯巴比妥的出峰时间在5～8min较为适合，而且该时段的峰形也较好。
在选择内标的时候，起初是用安定和氟安定，但由于两者的出峰时间都过长，因此没有考虑选择它们作为内标。一般较好的内标的出峰时间不宜和所测药物的出峰时间相差太大，这样会影响所测值的准确度，同时也要注意血清中一些杂质对其峰形的干扰。所以内标的出峰时间一般与所测药物的出峰时间相差2～5min左右为好。之后，又试用了茶碱、丙羟茶碱［5］，其保留时间为1.70、1.87min，出峰过早，与空白血清有干扰，不能作为内标。卡马西平、苯妥英钠保留时间为13.61、18.05min，出峰太晚，也不能作为内标。后来，把流动相比例做了调整，改为乙腈：水（30：70），此时苯巴比妥的保留时间为4.80min，没有血清的影响，可以使用。而卡马西平、咖啡因、异戊巴比妥的保留时间为11.57、1.83、9.71min，其中异戊巴比妥较为合适，所以最后选择其作为内标，流动相也定为乙腈：水（30：70）。 但是，在制作标准曲线的过程中，测定血清中所含的苯巴比妥时，使用内标所得的曲线并不是很理想，而且内标和苯巴比妥的峰形也不是很好。这些都会或多或少得影响最后的实验结果。所以，最后决定该实验不用内标。流动相相应调整为乙腈：水（25：75）。用测得的峰面积和浓度来建立坐标，制作标准曲线。 在配制含苯巴比妥5.0、10、20、40、60、80μg/ml的血清标准液时，要注意始终都要使用同一个移液枪，以平衡仪器本身所产生的误差。另外，在配制不同浓度的血清标准液时，一般先配制高浓度的，再依次稀释来配制低浓度的。用此方法相对来说比单独配制每一个浓度的方法误差要小一些。同时实验操作中要注意同步性，以减少不必要的误差，使实验结果更精确，更可靠。 在样品预处理时，特别要注意同步操作。在用乙醚提取血清中的苯巴比妥时，要充分振摇，每一个试管都要用力均匀，一般振摇3min为佳。因为笔者试过振摇2min和3min所提取的苯巴比妥会有所增加，证明振摇2min还没有完全提取血清中的药物，而振摇4min和振摇3min所提取的药物差不多。这足以证明振摇3min为最佳方法。 在水浴挥干乙醚时，温度最好在40℃左右。因为低于40℃，乙醚难以挥发。而大于45℃可能会使苯巴比妥和乙醚一起挥发，从而影响测定的结果，甚至可能测不出所要的结果。因为所测药物已被丢失。同时在挥干乙醚时，要注意不要让乙醚沸腾冒泡，因为这样也会使药物丢失，而造成结果的不正确。 在用流动相复溶后，最好再振摇一下，并用离心机离心，时间不要太久。因为用高效液相法测定的浓度一般都是很微量的，这样做可以使苯巴比妥充分溶解，离心后，即可使离心管上面的溶液沉积在管底，而且也可以离心分离出杂质，防止在进样时把杂质带入高效液相色谱柱，损害仪器的精密度，影响测定结果。 在测定日间和日内精密度时，实验操作的同步性十分重要。在日内精密度测定操作中，高、中、低三个浓度的各6点， 共18个待测品要同步操作。而对于日间精密度，每天的操作方法要一致，这样得出的数值才具有意义。
【参考文献】
1 张兰,王增寿, 朱光辉,等.我院抗癫痫药物血药浓度监测回顾分析.海峡药学， 2007，19（8）：105-107.
2 赵慧,邱雯.RP-HPLC同时测定苯巴比妥、苯妥英和卡马西平的血药浓度.兰州大学学报：医学版,2007,33（3）:54-58.
3 胡德福，王飞.高效液相色谱法测定苯巴比妥片的含量.中国药业，2004，13（5）：35-36.
4 杨志宏，刘晓东，谢林，等.LC-MS法测定大鼠脑部海马区中苯巴比妥的含量.中国药科大学学报,2006,37（2）：142-145.
5 张怡. HPLC测定复方长效氨茶碱片中茶碱和苯巴比妥含量.药物分析杂志,2000, 20（2）: 132-133.
作者单位：浙江富阳，富阳市人民医院