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【摘要】 目的 建立同时测定三叶青中槲皮素和山奈酚的HPLC方法。方法 色谱柱：phenomenex C18(250mm×4.60 mm，5μm);流动相：甲醇-0.4%磷酸(60:40);检测波长：370nm;流速：1.0ml/min。结果 槲皮素的线性范围为0.0497～0.1491μg，平均回收率为98.32%，RSD为1.64%(n=6);山奈酚的线性范围为0.0246～0.123μg，平均回收率为98.39%，RSD为1.84%(n=6)。结论 该方法简单、快速、准确，可为三叶青药材的质量控制提供实验依据。
【关键词】 高效液相色谱法;三叶青;槲皮素;山奈酚
Simultaneous determination of quercetin and kaempferol in Tetrastigmatis hemsleyani by HPLC
ZHOU Guo-hui，HUANG Jian-cheng，HUANG Zhen-bo. Center for Disease Control and Prevention of Heyan,Guangdong 517300,China
【Abstract】 Objective To develop an HPLC method for simultaneous determination of quercetin and kaempferol in Tetrastigmatis hemsleyani.Methods The HPLC system consisted of phenomenex C18 column (250mm×4.60mm,5μm), methanol-0.4%phosphate acid (60:40)as mobile phase, flow rate of 1.0mL·min-1. The detection wavelength was at 370nm.Results The linear ranges of quercetin and kaempferol were 0.0497～0.1491μg ( r= 0.9999) , 0.0246～0.123μg (r=0.9997)，,and the average recoveries were 98.32% with RSD 1.64%( n=6),98.39% with RSD 1.84%( n=6), respectively.Conclusion This method is simple，fast and accurate, and can be used to control the quality of Tetrastigmatis hemsleyani.
【Key words】 HPLC;Tetrastigmatis hemsleyani;quercetin;kaempferol
三叶青(Tetrastigmatis hemsleyani)又名有角乌蔹莓、石老鼠，为葡萄科崖爬藤属植物叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)[1]。主要分布于长江以南各地，生于阴湿山坡、山沟或溪谷旁林下，以块根或全草入药，具有清热解毒、祛风化痰、活血祛风的功效[2]。药理研究证实槲皮素和山奈酚等黄酮类化合物是三叶青抗菌、止血、抗氧化的主要有效成分[3，4]。目前有关三叶青中多种成分含量同时测定方面的研究还未见报道。本文采用了高效液相色谱法同时对三叶青中槲皮素和山奈酚进行了测定，为初步建立三叶青药材质量控制方法及其制剂的质量标准提供了依据。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪：岛津LC-10A液相色谱仪，SPD-10A紫外检测器，南宁威玛龙色谱工作站。色谱柱为phenomenex C18(250mm×4.60mm，5μm);槲皮素对照品(100081-200406)购自中国药品生物制品检定所;山奈酚对照品(110861-200405)购自中国药品生物制品检定所。三叶青药材产自广西，经浙江大学现代农业示范中心周建华老师鉴定为Tetrastigmatis hemsleyani的干燥根;甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素和山奈酚对照品适量，加甲醇制成每1ml含槲皮素9.94μg和山奈酚7.38μg的混合对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末2.0g，精密称定，置50ml磨口圆底烧瓶中，精密加入5%盐酸溶液和70%乙醇(1:4)混合溶液25ml，称定重量。水浴回流2h，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液过0.45μm的微孔滤膜，滤液作为供试品溶液。
2.3 色谱条件 色谱柱phenomenex C18(250mm×4.60mm，5μm)，柱温30℃;流动相甲醇-0.4%磷酸溶液(60:40)，流速1.0ml/min ，检测波长370nm。
2.4 测定法 分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各l0μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件，以外标法计算含量。见图1。
图1 槲皮素、山奈酚混合对照品(A)和三叶青样品HPLC色谱图(B)
1.槲皮素 2.山奈酚2.5 线性关系考察 精密吸取槲皮素和山奈酚混合对照品溶液适量，共5份，分别置于10ml量瓶中，加入甲醇至刻度，使槲皮素质量浓度分别为4.97、7.455、9.94、12.425、14.91μg/ml,使山奈酚质量浓度分别为2.46、4.92、7.38、9.84、12.3μg/ml,各精密吸取l0μl注入高效液相色谱仪，依法测定，以峰面积积分值(Y)为纵坐标，进样浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，得到槲皮素和山奈酚的线性回归方程分别为：Y=63337X-22810.5，r=0.9999Y=49937X+4690，r=0.9997结果表明：槲皮素在0.0497～0.1491μg范围内具有良好的线性关系，山奈酚在0.0246～0.123μg范围内具有良好的线性关系。
2.6 精密度考察 取同一混合对照品溶液，分别重复进样6次，测定结果，对照品溶液中槲皮素RSD=0.42%(n=6)，山奈酚RSD=0.54%(n=6)。
2.7 重复性试验 取本品6份，精密称定样品，按“含量测定”项下样品含量测定的方法操作，制成供试品溶液，测定槲皮素的平均含量为99.12μg/g，RSD为1.21%;山奈酚的平均含量为101.67μg/g，RSD为1.22%。
2.8 稳定性试验 将供试品溶液在室温下贮存，于0、2、4、8、12h测定，结果样品溶液在12h内基本稳定，槲皮素和山奈酚RSD分别为0.86%和1.13%。
2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品共6份，约1g，分别加入等量槲皮素和山奈酚对照品，照供试品方法制备，测定含量，槲皮素和山奈酚平均回收率分别为98.32%和98.39%, RSD分别为RSD=1.64%(n=6)和1.84%(n=6)，结果见表1。表1 加样回收率试验结果
2.10 样品测定 按“2.2”项下方法,制备供试品溶液,测定3份三叶青药材中槲皮素和山奈酚的含量,测定结果见表2。表2 三叶青中槲皮素和山奈酚的含量(μg/g)
3 讨论
分别选择甲醇-水溶液(50:50)、甲醇-水溶液(60:40)、甲醇-0.4%磷酸溶液(50:50) 和甲醇-0.4%磷酸溶液(60:40)为流动相进行试验，结果甲醇-0.4%磷酸溶液(60:40)的分离效果较好。实验中曾采用不同溶剂对药材进行提取，分别用95%乙醇、70%乙醇、甲醇、70%甲醇、5%盐酸溶液和70%乙醇(1:4)混合溶液、5%盐酸溶液和70%甲醇(1:4)混合溶液进行提取，含量测定结果显示,槲皮素和山奈酚在70%乙醇溶液且在酸性条件下提取效果较好;同时还采用5%盐酸溶液和70%乙醇(1:4)混合溶液、25%盐酸溶液和70%乙醇(1:4)混合溶液进行提取,对槲皮素和山奈酚进行含量测定。结果槲皮素和山奈酚含量无明显差异，考虑到酸性过强对色谱柱的损害，故本实验选用5%盐酸溶液和70%乙醇(4:1)混合溶液进行提取;比较了超声提取和加热回流提取效果,发现回流提取的组分分离较好,同时槲皮素和山奈酚的峰面积都明显大于超声提取,因此样品采用回流提取;另外,分别将样品回流提取0.5、1、1.5、2、2.5h,发现槲皮素和山奈酚在2～2.5h内山奈素的含量提高不明显,故本实验的样品处理中采用2h的提取时间。目前,对三叶青药材的研究较少, 有关三叶青中多种成分含量同时测定方面的研究还未见报道,本实验建立了三叶青药材中槲皮素和山奈酚的含量测定方法,且方法简单可行，重复性好,结果准确可靠,可为三叶青药材及其制剂的质量标准的建立提供一定的参考。
【参考文献】
1 国家中医药管理局. 中华本草. 上海：上海科学技术出版社，1999，448-451.
2 伍昭龙，吕江明.中药三叶青的研究现状. 中国民族民间医药杂志, 2006，(1)：15-18.
3 刘东,杨俊山.中国特有植物三叶青化学成分的研究.中国中药杂志,1999,24(10):611-612.
4 刘东, 鞠建华, 林耕，等. 三叶崖爬藤中的新黄酮碳甙. 植物学报, 2002,(44):227-229.
(编辑:汪 洋)