Survivin基因反义核酸对人喉癌细胞系的生长抑制作用

　　【摘要】  目的  探讨Survivin基因反义核酸(AS-ODN)对人喉癌细胞系的生长抑制作用。方法 以高表达Survivin基因的人喉癌细胞系HeP-2为靶细胞、反义Survivin (AS-ODN)为阻断剂，通过MTT试验观察AS-ODN对喉癌细胞系的生长抑制作用，RT-PCR分析Survivin基因反义核酸(AS-ODN)对Survivin基因表达的影响。结果 AS-ODN明显抑制了喉癌细胞HeP-2的生长及其Survivin基因表达(P<0.05)。HeP-2在AS-ODN作用下，细胞数量明显减少。结论  Survivin基因的反义核酸(AS-ODN)对喉癌细胞的生长可能起十分重要的作用，有望成为喉癌治疗的新靶点。

　　【关键词】  Survivin基因；反义核酸；喉癌细胞系
   
　　Inhibitory effects of AS-ODN of Survivin gene on cultured HeP-2 cell lines

　　GUO Wan-hong，ZHANG Hui-zhong，LI Jun-zheng，et al.

　　Department of Otolaryngology，The 254th Hospital of PLA，Tianjin 300142，China

　　【Abstract】  Objective  To investigate the inhibition of AS-ODN of Survivin gene on cultured human larynx carcinoma cell lines.Methods With HeP-2 cell lines of human larynx carcinoma for target cell and AS-ODN for blocking agent，using MTT method to observe the inhibitory effects of AS-ODN on cultured human larynx carcinoma cells. RT-PCR were performed for survivin  gene expression.Results  The growth of carcinoma of larynx cells and the expression of Survivin gene were suppressed by AS-ODN (P<0.05).Conclusion  The AS-ODN of Survivin gene may play a crucial role in the growth of larynx carcinoma cells. It may be a novel target of treatment to larynx carcinoma.

　　【Key words】  Survivin gene；antisense oligonucleotide；carcinoma of larynx cell lines
   
　　Survivin是近年来发现的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）家族的新成员，它在肿瘤发生、发展过程中的作用已受到了学者们的广泛关注。我们用人工合成的互补于Survivin 基因的反义寡核苷酸(AS-ODN)，阻断Survivin 高表达的人喉癌细胞系HeP-2，探讨对其生长抑制作用，为喉癌的基因治疗提供理论和实验依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  人喉癌细胞系HeP-2由第四军医大学唐都医院中心实验室保存；TRIZOL及脂质体转染试剂盒购于Gibco公司，逆转录试剂盒购于Promega公司，胰蛋白酶均购于宝生物工程(大连)有限公司，反义Survivin核酸(AS-ODN)及用于对照的正义S-ODN合成于上海博亚生物技术有限公司，基因序列全硫代修饰。S-ODN:5'- ATG GGT GCC CCG ACG TTG CC -3'; AS-ODN:5'-GGC AAC GTC GGG GCA CCC AT-3'。

　　1.2  方法

　　1.2.1  细胞转染  HeP-2细胞用含 10％小牛血清的RPMI1640培养液在37℃、5％CO2的培养箱中培养，将生长状况良好的细胞经胰酶消化，血细胞记数板记数，接种于24孔细胞培养板（ Hep-2细胞每孔1×104个），37℃培养过夜，在Lipofectin介导下进行寡核苷酸的转染（操作见试剂盒说明书）， 寡核苷酸终浓度为20μmol/L，6h后加入含10％血清的 RPIM1640终止。细胞对照孔内加入含相同浓度Lipofectin的RPIM1640培养
液。

　　1.2.2  AS-ODN对HeP-2细胞生长的抑制试验  将转染后的各组细胞制成1×107/L的细胞悬液，取0.2ml接种于96孔培养板，分别标记正义组、空白组及反义组。每组设16个复孔，常规培养，分别于培养后1、2、3、4天每组各取4个复孔进行MTT实验，每孔加入MTT溶液20μl(20mg/L)，培养4h后，每孔加入DMSO 150μl，酶联免疫检测仪测定490nm处各孔A值，并计算细胞生长抑制率，公式：细胞生长抑制率（%）=（对照组平均A值-实验组平均A值）/对照组平均A值×100%。

　　1.2.3  RT-PCR分析  将转染后的上述各组细胞制成1×107/L的细胞悬液，培养2天后分别取各组细胞5×106个提取总RNA，以Oligod T为引物进行逆转录，并取0.5μg逆转录产物对Survivin基因、内对照GAPDH基因进行PCR扩增。Survivin基因上游引物序列：5'-CAT ATG GGT GCC CCG ACG TTG CC-3'；下游引物序列：5'-CTC GAG TCA ATC CAT GGC AGC CAG C-3'。GAPDH基因上游引物：5'-GTG AAG GTC GGT GTC AAC G-3'；GAPDH基因下游引物：5'-GGT GAA GAC GCC AGT AGA CTC-3' （引物均由上海博亚生物技术合成）。扩增片段长度分别为438bp、300bp， PCR实验重复3次。以各组与GAPDH的电泳条带密度扫描的比值作为基因表达的相对量。计算公式：基因表达的相对量=(目的基因带密度-背景密度)/（GAPDH带密度-背景密度)。

　　1.2.4  统计学方法  实验数据以均数±标准差（±s）表示，用SPSS 10.0软件进行方差分析。

　　2  结果

　　2.1  MTT实验分析结果  与正义组及空白对照组相比，反义组对HeP-2
细胞生长具有明显的抑制作用，统计分析差异有显著性(P<0.05)，正义组与空白对照组相比差异无显著性（P＞0.05），见表1、图1。

　　表1  不同时间药物对Hep-2细胞生长的影响  (略)

　　图1  MTT法检测不同时间AS-ODN对喉癌Hep-2细胞生长的影响　略

　　2.2  RT-PCR比较分析结果  Survivin基因的相对表达量在正义组及空白对照组分别为1.29±015、1.31±0.16，差异无显著性(P>0.05)，而在反义组中相对表达量为0.82±0.18，均低于前两者并且差异有显著性(P<0.05)。

　　3  讨论

　　反义核酸技术是近十几年兴起的一种生物高新技术，用反义技术封闭和抑制特定基因的表达是目前肿瘤基因治疗中的一个重要方面。反义寡核苷酸通过序列特异性地与靶mRNA结合而阻断其翻译，阻断由基因到蛋白质的信息传递，抑制蛋白质的表达。Survivin是一个由142个氨基酸组成的蛋白质，是一种很强的凋亡抑制因子，可以直接作用于Caspase，主要是通过抑制Caspase-3、Caspase-7的活性来阻断细胞的凋亡过程，另外Survivin亦可通过p21间接抑制Caspase而起作用［1，2］；Survivin的组织分布特征具有明显的细胞选择性，在终末分化的成人组织中不表达（除胸腺、生殖腺外），而在绝大多数恶性肿瘤组织中有表达［3，4］，Survivin在癌组织中的表达是一个渐进的过程，且与恶性肿瘤的侵袭性及预后有关［5，6］。因此，抑制Survivin基因或蛋白的表达将不会对机体产生较大的影响，这也就为进行Survivin的反义治疗提供了前提条件。

　　本实验中，我们利用反义核酸技术抑制Survivin表达，其活性被封闭后，喉癌HeP-2细胞的增殖出现障碍，说明Survivin基因在维持喉癌HeP-2细胞的生长中起十分重要的作用。从表1、图1可看出：AS-ODN具有抑制HeP-2细胞生长的作用，而S-ODN无此作用。结果说明，Survivin基因反义核酸能有效地抑制喉癌细胞的生长，为开发喉癌基因治疗提供了实验基础。我们认为Survivin基因是喉癌基因治疗的新靶点，应进一步探索其中的机制，为喉癌及其他恶性肿瘤的基因治疗提供新的理论依据。

　　【参考文献】

　　1  Kania J，Konturek SJ，Marlicz K，et al. Expression of survivin and caspase-3 in gastric cancer . Dig Dis Sci，2003，48(2):266-271.

　　2  Suzuki A，Ito，Kawano H，et al. Survivin initiates procaspase 3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fas-mediated cell death. Oncogene，2000，19(10)：1346-1353.

　　3  Kennedy SM，O'Driscoll L，Purcell R，et al. Prognostic importance of survivin in breast cancer . Br J Cancer，2003，88(7):1077-1083.

　　4  Ikeguchi M，Hirooka Y，Kaibara N.Quantitative analysis of apoptosis-related gene expression in hepatocellular carcinoma.Cancer，2002，95(9):1938-1945.

　　5  Zaffaroni N，Daidone MG. Survivin expression and resistance to anticancer treatments: perspectives for new therapeutic interventions. Drug Resist Updat，2002，5(2):65-72.

　　6  Ikeguchi M，Yamaguchi K，Kaibara N. Survivin gene expression positively correlates with proliferative activity of cancer cells in esophageal cancer.Tumour Biol，2003，24(1):40-45.

　　作者单位：1 300142 天津，解放军第254医院耳鼻喉科

　　　　　　　2 710038 陕西西安，第四军医大学唐都医院中心实验室

　　(编辑：新  竹)