点击显示 收起
【摘要】 目的 观察HPV16早期基因E6/E7表达蛋白与Rb蛋白在喉癌发生中的相关性，为喉癌的病因学探索提供依据。方法 用免疫组织化学方法检测82例喉鳞癌、39例非癌组织标本中HPV16 E6/E7以及Rb的蛋白表达。结果 (1)HPV16 E6/E7和Rb蛋白表达的阳性率在非癌及喉癌组织中差异有显著统计学意义(P<0.01)，HPV16 E6/E7与Rb蛋白的阳性率在非癌组织中呈明显的负相关(P<0.01);(2)喉癌组织中，Rb蛋白在HPV16 E7阳性及阴性组中的阳性率显著不同(P<0.01)，而在HPV16 E6和非癌组织中无此现象(P>0.05)。结论 喉癌组织中HPV16 E7的高表达是导致Rb蛋白功能失活的主要原因。
【关键词】 喉肿瘤;癌，鳞状细胞;HPV16 E6蛋白;HPV16 E7蛋白;Rb蛋白
Study on expression of HPV16 E6/E7 and Rb proteins in human laryngeal squamous cell carcinoma and their relationship
YE Qing，BI Jie，ZHANG Ting，et al.Department of Otolaryngology，Zhabei Branch of Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200070，China
Objective Observing the correlation of expression of HPV16 E6/E7 and Rb proteins in human laryngeal squamous cell carcinoma to give gists for the etiology search of laryngeal carcinoma.Methods The expression of HPV16 E6/E7 and Rb proteins were detected by the immunohistochemical method in 82 specimens with laryngeal squamous cell carcinoma and 39 specimens with non-carcinoma.Results (1)Between non-carcinoma and laryngeal squamous cell carcinoma tissues，there were different positive rates for the HPV16 E6/E7 and Rb proteins(P<0.01).Between the positive rates of the expression of HPV16 E6/E7 and Rb proteins，there were negative correlation significantly in non-carcinoma tissues(P<0.01);(2)In laryngeal squamous cell carcinoma tissue，there were different positive rates of Rb protein in HPV16 E7(+) and HPV16 E7(-) group(P<0.01);comparing HPV16 E6(+) and HPV16 E6(-) group or non-carcinoma tissues，there were no such difference(P>0.05).Conclusion The over expression of HPV16 E7 protein in human laryngeal carcinoma might be the main factor for the inactivation of Rb protein.
[Key words] laryngeal neoplasms;carcinoma，squamous cell;HPV16 E6 protein;HPV16 E7 protein;Rb protein
视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，Rb)肿瘤抑制基因编码的蛋白质pRb为一重要的肿瘤抑制因子，自发现以来已有许多学者对其进行了研究，发现在许多种类的人类肿瘤中有该蛋白质的变异或缺失。晚近更有学者观察了pRb与喉癌发生的相关性，王斌全等[1]发现，喉癌组织中存在Rb的突变，但Rb基因突变与喉癌病程无关，认为Rb基因突变在喉癌的发生发展中起着一定的作用。英信江等[2]发现，随着喉癌病理及临床分级的提高，喉癌组织中人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)16型的早期基因E7表达的蛋白与pRb的表达呈显著的负相关。但前者的研究未揭示该Rb基因突变是否与HPV感染有关，后者的研究在全部喉癌标本中进行，为分别研究HPV16 E7蛋白阳性及阴性时pRb的表达情况并分析两者的相关趋势，尚不足以准确认定喉癌发生时pRb的低表达与HPV16 E7蛋白的表达是否相关。为明确pRb低表达的原因，本文进行了如下试验，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 组织标本 选取1996年以来在上海长征医院耳鼻咽喉科因喉部疾患住院手术的病理标本121例，经病理证实，其中喉鳞癌82例，非癌组织39例(声带息肉27例，距肿瘤>1.5 cm的癌周正常组织12例)。
82例喉鳞癌患者中，男80例，女2例，年龄38～85岁，平均(60.55±10.65)岁，按2002年国际抗癌联盟(UICC)标准进行临床分期，其中Ⅰ期13例，Ⅱ期17例，Ⅲ期30例，Ⅳ期22例;按肿瘤分化程度将其分为3级，其中Ⅰ级(高度分化)22例，Ⅱ级(中度分化)32例，Ⅲ级(低度分化)28例。所有患者术前未经放疗和化疗。
1.2 试剂 实验用兔抗人HPV16 E6单克隆抗体、兔抗人Rb单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司，兔抗人HPV16 E7单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，所用EnVisionTM+加强型免疫组织化学染色试剂盒(K400011)购自DAKO公司。
1.3 免疫组织化学方法(EnVision法) 将石蜡切片脱蜡至水;3%过氧化氢(H2O2)孵育10 min，用以清除内源性过氧化物酶，蒸馏水漂洗;加入单克隆抗体(兔抗人HPV16 E6或HPV16 E7或Rb)4 ℃过夜;EnVisionTM+孵育30 min，各步骤之间均用 PBS洗片，常规DAB显色5～10 min，复染，封片。染色时，用已知HPV16 E6，HPV16 E7和Rb反应阳性的宫颈癌切片作阳性对照，用PBS替代一抗作阴性对照。
1.4 阳性细胞判定标准 HPV16 E6，HPV16 E7和Rb蛋白均为细胞核染色，以出现棕黄色颗粒为阳性。确定阳性标准：在高倍镜下(×400)对每张切片随机选择5个视野，每个视野计数200个肿瘤细胞，共计1 000个。阳性细胞数<5%为阴性(-)，5%～25%为弱阳性(+)，25%～50%为中度阳性(++)，>50%为强阳性(+++)。(+)以上统称阳性表达，余为阴性表达。
1.5 统计学处理 根据资料类型采用χ2检验。
2 结果
2.1 HPV16 E6，HPV16 E7和Rb蛋白的染色结果 HPV16 E6，HPV16 E7和Rb蛋白阳性均表现为细胞核着色，阳性细胞核呈棕色或棕黄色细网状或粗大颗粒状，色泽深浅不等;阳性细胞多呈灶状或弥漫性分布，染色深(图1)。
2.2 HPV16 E6，HPV16 E7和Rb蛋白在不同喉黏膜病变中的表达 见表1。如将正常组织及息肉合并为非癌组织，经2×2表的χ2检验，由表1可知，HPV16 E6和HPV16 E7蛋白的表达从非癌组织到鳞癌呈上升趋势(P<0.01)，Rb蛋白的表达从非癌组织到鳞癌呈下降趋势(P<0.01)。
进一步分析发现，在非癌组织中，Rb蛋白与HPV16 E6和HPV16 E7蛋白的表达率呈明显的负相关(P<0.01)，提示喉癌的发生与喉癌组织中HPV16 E6、HPV16 E7的高表达和Rb蛋白的失活有关。
2.3 HPV16 E6，HPV16 E7与Rb蛋白的相关性 分别分析非癌与喉癌组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性和阴性时Rb蛋白的表达情况，结果见表2。由表2可知，经2×2表的χ2检验，在非癌组织中，Rb蛋白的阳性率在HPV16 E6、HPV16 E7阳性和阴性时差异均无显著性(P>0.05);在喉癌组织中，Rb蛋白的阳性率仅在HPV16 E7阳性和阴性时差异有显著统计学意义(P<0.01)。进一步提示Rb蛋白的功能失活仅与HPV16 E7蛋白的表达有关。表1 HPV16 E6，HPV16 E7和Rb蛋白在同喉黏膜组织中的表达注：HPV16 E6与HPV16 E7比较，aP<0.01;与非癌组织比较，bP<0.01表2 HPV16 E6，HPV16 E7和Rb蛋白的相关性 注：与HPV16 E7(+)比较，aP<0.01
3 讨论
高危型HPV如HPV16在其增殖期需要其早期基因E6、E7的表达[3，4]，有学者观察到，在永生化口腔上皮细胞中，E6通过硫化磷酸化Rb蛋白形成复合物使其失活[5]，E7则主要通过其化学结构与Rb蛋白结合掩蔽其生物活性使Rb蛋白功能失活[6]。Rb作为一重要的抑癌基因，其表达产物pRb在肿瘤的控制中显然起着举足轻重的作用，消除引起pRb功能失活的因素，恢复其正常活力应是喉癌免疫学和基因学治疗研究的焦点。
尽管通过不同的途径，E6、E7均能引起pRb的功能失活，Sdek等[5]在口腔上皮的永生化实验中发现，以HPV16 E6及E7的开放阅读框转染正常人口腔上皮，E7在废除口腔上皮细胞的细胞周期调节中起重要作用，而E6只有较小的影响。本组的试验结果也提示在喉鳞状细胞癌中，pRb的功能失活主要与E7的表达有关，而与E6基本无关，为赵舒薇等[7]以HPV16 E7-HSP70融合基因的表达蛋白用于喉癌疫苗的研制工作提供了依据。
【参考文献】
1 王斌全，陈彦球，温树信，等.喉癌组织RB基因突变及其与临床分期的关系.临床耳鼻咽喉科杂志，2003，17(2)：89-91.
2 英信江，赵舒薇，邱杰，等.HPV16 E7蛋白和Rb蛋白在人喉鳞状细胞癌中的表达及相关性研究.第二军医大学学报，2004，25(12)：1364-1367.
3 Asha S Collins，Tomomi Nakahara，Anh Do，et al.Interactions with pocket proteins contribute to the role of human papillomavirus type 16 E7 in the papillomavirus life cycle.Journal of Virology，2005，79(23)：14769-14780.
4 Catherine A Harwood，Jane M McGregor，Charlotte M Proby，et al.Human papillomavirus and the development of non-melanoma skin cancer.J Clin Pathol，1999，52：249-253.
5 Sdek P，Zhang Zhi-yuan，Cao Jun，et al.Alteration of cell-cycle regulatory proteins in human oral epithelial cells immortalized by HPV16 E6 and E7.Int J Oral Maxillofac Surg，2006，35(7)：653-657.
6 Alonso LG，Smal C，Garcia-Alai MM，et al.Chaperone holdase activity of human papillomavirus E7 oncoprotein.Biochemistry，2006，45(3)：657-667.
7 赵舒薇，邱杰，英信江，等.HPV16 E7-HSP70融合基因原核表达质粒的构建和鉴定.中国耳鼻咽喉头颈外科杂志，2006，13(2)：67-70.