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【摘要】 目的 观察S-100蛋白（S-100）和组织蛋白酶D（cathepsin D，CAD）在先天性巨结肠（Hirschsprung's disease，HD）中的表达。 方法 应用免疫组织化学染色观察25例HD患儿及10例对照组儿童结肠。 结果 （1）在正常对照组与HD扩张段组肠壁肌间和黏膜下层可见CAD只对神经丛中神经节细胞阳性表达，对神经纤维与神经胶质细胞均不表达。S-100染色与CAD染色相反，神经纤维与神经胶质细胞均阳性表达，神经节细胞阴性表达，表现为阳性神经丛中细胞状“空白区”。（2）在HD狭窄段组肠壁神经丛中缺乏CAD阳性表达。S-100染色神经丛中细胞状“空白区”未观察到;S-100强阳性表达的神经纤维束显著增生，扭曲呈波浪状。 结论 S-100和CAD的免疫组化染色对诊断HD具有重要意义。
关键词 先天性巨结肠 组织蛋白酶D S-100蛋白
Application of S-100protein and cathepsin D in diagnosis of Hirschsprung's disease
Chen Weijian，Zhou Xiaoyu，Li Liping，et al.
Hunan Provincial Children's Hospital，Changsha410007
【Abstract】 Objective To observe the expression of S-100protein（S-100）and cathepsin D（CAD）in the colon of patients with Hirschsprung's disease（HD）.Methods Colons from25children with HD and10controls were stained for S-100and CAD by immunohistochemistry.Results （1）In the controls and the dilated intestine segment of the HD，CAD-positive ganglionic cells were observed in myenteric and submucosal plexus.S-100positive nerve fibers and gliocyte stained were negative to CAD.The ganglionic cells-like blank area in the plexus stained were negative to S-100.（2）In the stenotic segment of HD，neither CAD-positive neurons nor cell-like blank area in S-100stained were found in the plexus.S-100positive fibers were proliferated obviously and wave-like in their appearance.Conclu-sion The expression of S-100and CAD immunohistochemistry-staining has an important significance to the confirmed diagnosis of HD.
Key words Hirschsprung's disease cathepsin D S-100protein
先天性巨结肠（Hirschsprung's disease，HD）是小儿外科常见的消化道畸形，主要病理改变是远端病变段肠管神经节细胞缺如。在HD的病理诊断中，有部分病例，尤其是新生儿病例，由于肠壁神经系统发育不完全，神经节细胞欠成熟，形态不典型，与神经丛中神经胶质细胞难以鉴别。而且多数患儿并发肠道感染，肠壁内有较多炎细胞浸润，使HE切片中神经节细胞难以辨认。这些原因均可造成HD不易明确诊断。本研究应用免疫组织化学（免疫组化）方法，观察正常肠壁、HD扩张段和HD狭窄段肠壁神经组织中S-100蛋白（S-100）和组织蛋白酶D（cathepsin D，CAD）的表达结果，加以分析，以明确诊断HD。
1 资料与方法
1.1 一般资料 回顾我院2002年6月～2004年6月临床拟诊断为HD的手术切除标本25例。男22例，女3例，年龄1个月～4岁，其中≤3个月10例，>3个月15例，均经术后病理检查证实为HD，23例为常见型，2例为长段型。每例标本分别取近端扩张段切缘肠壁作为HD扩张段组，取远端狭窄段肠壁作为HD狭窄段组。10例横结肠或乙状结肠标本取自先天性无肛患儿造瘘术后切除的肠管，经光镜检查可见发育成熟的神经节细胞，作为正常对照组。
1.2 检测原理 CAD是一种天冬氨酸蛋白酶，属于溶酶体酸性蛋白酶家族。在人类脑组织神经元、体内神经节细胞中含量丰富，故可作为肠壁神经节细胞的标记。S-100是神经胶质细胞特异性蛋白，亦可存在于神经纤维中，可作为肠道神经丛中胶质细胞和神经纤维的标记。
1.3 方法 标本经10%福尔马林固定、石蜡包埋，连续切片，切片厚4μm，行CAD和S-100免疫组化染色。染色步骤采用非生物素两步法，用已知阳性的神经节细胞瘤作为阳性对照片，用PBS代替一抗作为阴性对照片，DAB显色。一抗、二抗及DAB显色剂均购自上海长岛抗体生物诊断试剂有限公司。一抗抗CAD抗体和抗S-100抗体工作浓度均为1∶60，鼠/兔通用型二抗工作浓度为1∶100。观察正常肠壁、HD扩张段和HD狭窄段肠壁神经丛中神经节细胞、神经胶质细胞及神经纤维的染色结果。
1.4 结果判断 棕黄色为阳性信号，CAD、S-100的阳性表达部位均位于细胞质。观察指标以“+++、++、+、-”表达染色的深浅。（-）为阴性染色，（+）为弱阳性染色，（++）为阳性染色，（+++）为强阳性染色。
2 结果
2.1 正常对照组
2.1.1 CAD 肠壁肌间与黏膜下层神经丛中可见CAD阳性染色的细胞状棕黄色颗粒（见图1），经与HE切片对比后证实为神经节细胞的胞浆。神经节细胞的染色强度不一样，肌间神经丛内神经节细胞着色强于黏膜下神经丛。神经丛中神经纤维和神经胶质细胞中CAD均为阴性染色。在黏膜和黏膜下层中，有散在组织细胞，呈CAD弱阳性染色。
2.1.2 S-100 S-100对神经丛中神经纤维和神经胶质细胞表达均为阳性染色，在阳性染色的神经丛中可以观察到一种特征性形态，表现为深染的神经丛中有细胞状“空白区”（见图2）。经与HE及CAD染色切片对照后发现细胞状“空白区”总是出现在神经节细胞的位置。
2.2 HD扩张段 CAD和S-100在HD扩张段肠壁的染色情况与对照组肠壁基本相同。
2.3 HD狭窄段
2.3.1 CAD 肠壁神经丛内缺乏CAD阳性染色神经细胞或神经纤维。
2.3.2 S-100 肠壁肌间与黏膜下层神经丛内均未观察到细胞状“空白区”。肠壁各层都可见S-100强阳性的神经纤维束显著增生，形态扭曲呈波浪状（见图3，4）。
正常对照组、HD扩张段组和HD狭窄段组肠壁神经组织对S-100、CAD表达情况见表1。
表1 正常对照组、HD扩张段组和HD狭窄段组肠壁神经组织对S-100及CAD表达情况（略）
注:n为标本例数
3 讨论
HD在小儿胃肠道先天性畸形中发病率居第二位。HD的确诊依据是远端病变肠壁肌间与黏膜下层神经节细胞缺如。但是在神经嵴细胞的迁移、增生和发育的过程中，受多种因素的影响，神经节细胞可能完全没发育，也可能是发育不成熟。尤其在新生儿期这种发育不成熟的神经节细胞更常见，其在光镜下的形态与神经丛中的胶质细胞不易鉴别，加上炎症细胞的影响，可能造成误诊。借助酶组织化学和免疫组化染色方法可以帮助诊断。但酶组织化学方法染色结果不稳定，容易出现假阳性，需要有经验的病理医师对染色结果做出正确的判断。采用免疫组化染色标记神经节细胞，对HD明确诊断有较好的帮助。
S-100是一组可溶性、相对低分子质量、高酸性蛋白，属神经胶质细胞特异性蛋白，亦可存在于神经纤维中。在研究肠神经系统的形态特征及结构特征中，S-100有良好的表达功能 ［1］ 。本研究中10例正常对照者肠壁与25例HD患儿扩张段肠壁肌间和黏膜下层均可见S-100阳性染色的神经纤维丛中有细胞状“空白区”，与HE切片比较后发现，细胞状“空白区”总是出现在神经节细胞所处的位置。在25例HD患儿狭窄段肠壁的肌间和黏膜下层中，S-100染色细胞状“空白区”均未观察到。因此笔者认为，S-100染色中出现的细胞状“空白区”是神经节细胞的特征性表现 ［2］ 。S-100可作为观察神经节细胞的指标之一。
CAD是一种天冬氨酸酶，属于溶酶体酸性蛋白酶家族，其在细胞内蛋白质的分解代谢中起着关键作用，可催化许多神经肽的降解，如P物质、生长抑素、B脂蛋白和血管紧张素原。由于CAD在人类脑组织神经元、体内神经节细胞中含量丰富，故可作为肠壁神经节细胞的标记 ［3］ 。本研究的结果与其他学者 ［3，4］ 报道的一致。即在结肠壁中，CAD的免疫反应性仅局限于神经节细胞，神经纤维和神经胶质细胞均无阳性染色。本组25例HD患儿狭窄段肠壁全部缺乏CAD阳性表达，而10例对照组和25例HD患儿扩张段肠壁均可见CAD染色阳性的神经节细胞。这与常规病理检查结果相一致。说明CAD对神经节细胞具有较高的特异性表达。在新生儿的病例中，CAD的阳性表达同样容易看到。
组织学研究已经证明，正常人的肠内神经节细胞数目出生后已固定，但有一个成熟过程，即随着年龄增长，大而成熟的神经节细胞数目逐渐增多，不成熟的神经节细胞比例减少 ［5］ 。在本研究的结果中观察到，虽然神经节细胞对CAD均为阳性表达，但不同部位的阳性染色程度不一致，表现为神经节细胞胞质中棕黄色颗粒物数量与颜色深度均存在差异。肌间神经丛内神经节细胞染色一般强于黏膜下神经丛。比较HE切片与CAD染色切片还发现，在HE切片中观察到的细胞核大、细胞质丰富的神经节细胞表达CAD较强，而细胞核小、细胞质较少或不明显的神经节细胞对CAD的表达相对较弱。这可能与神经元发育不成熟或发育不良有关 ［4］ 。也可以说明染色深浅不同的神经节细胞其成熟程度不同，成熟的神经节细胞染色较深。因此，笔者认为CAD不仅可以作为神经节细胞的特异性标记物，还可以检测肠道神经系统中神经节细胞的成熟程度，作为对临床预后情况评估的指标。对于手术扩张段近端切缘中无CAD表达或神经节细胞CAD阳性表达程度较低的病例，应该密切观察，以免术后并发肠神经发育不良症引起肠梗阻。
在所有标本的黏膜层和黏膜下层可看到少数CAD弱阳性表达的细胞散在分布。经CD68染色证实为组织细胞。虽然组织细胞对CAD也为阳性表达，但组织细胞与神经节细胞不难鉴别:（1）组织细胞常有长而扭曲的细胞核，缺乏明显的核仁;神经节细胞核大而圆似“枭眼状”，核仁清晰。（2）组织细胞常单个存在或与淋巴细胞同时出现，远离神经丛和神经纤维 ［3，4］ 。
研究结果中神经纤维束异常增生的原因目前还不完全清楚，有学者认为异常增生的神经纤维束可能来自肠壁外的神经组织 ［2］ 。虽然这些异常增生的神经纤维束对HD不具诊断性意义，但是如果在病变肠壁的肌间或黏膜下层都找不到这种扭曲粗大的神经纤维束，则诊断HD应该慎重。
综上所述，CAD是肠神经节细胞特异性较高的标志物，对不同成熟程度的神经节细胞表达强度不同，不仅可以特异性标记神经节细胞，而且可以判断神经节细胞的成熟程度，用于评估预后。S-100对神经节细胞阴性表达可以形成具有特征性的细胞状“空白区”，与CAD的阳性表达对比观察，同时应用，对HD的诊断有较大的帮助。这两种抗体的免疫组化染色均能用于常规固定、石蜡包埋的组织，方法简单，染色结果便于观察与判断，故可作为诊断HD的一种有效的辅助手段。
（本文图片见封三）（略）
参考文献
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（编辑唐 城）
作者单位:410007湖南长沙湖南省儿童医院儿科学研究所
410007湖南长沙湖南省儿童医院外科