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【摘要】 目的 探讨重组人红细胞生成素(rhEPO)对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)、脑水肿及NO、MDA含量的影响。方法 选用7日龄Wistar大鼠80只随机分为4组,即假手术组、缺氧缺血性脑病组（即生理盐水对照组）、促红细胞生成素(rhEPO)治疗组、硫酸镁治疗组,每组各20只。后3组制备HIBD模型前30min分别腹腔内注射生理盐水、rhEPO及硫酸镁。4组动物48h后处死,随即取鼠分别给予4种处理：（1）取脑组织常规固定、切片、行H-E染色,观察脑组织的病理改变；（2）一组取脑组织精确称重后，置于恒温烤箱内48h后称干重求出脑的含水量；（3）取脑制成组织匀浆，测NO含量；（4）取脑制成组织匀浆，测MDA含量。结果 假手术组脑的含水量及NO和MDA含量均明显低于HIBD组，差异有显著性(P<0.05); rhEPO治疗组测定值明显低于生理盐水对照组(P<0.05),而与硫酸镁治疗组相比差异无显著性(P＞0.05)。结论 促红细胞生成素(rhEPO)和硫酸镁一样对脑缺氧缺血具有保护作用，可以减轻脑水肿，抑制自由基的生成。
【关键词】 鼠；缺氧缺血性脑损伤；促红细胞生成素；脑水肿；一氧化氮； 丙二醛
Protective effects of rhEPO on hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats
YAO Li,ZHANG Yu-jing,YU Xin-yan.
Department of pediatrics,the Second affiliated Hospital of Harbin Medical University,Heilongjiang 150086,China
【Abstract】 Objective To observe the effects of recombinant human erythropoietin (rhEPO) on the cerebral edema and the contents of NO, MDA of the hypoxic-ischemic rat brain. Methods 80 infant Wister rats of 7 days' old were distributed randomly into 4 groups with 20 infant rats for each group: sham-operated control group, hypoxic-ischemic brain damage (HIBD) group, rhEPO treated group and MgSO4 treated group. Each rat in the last 3 group was killed at 48 hours after HIBD. rats were randomly taken out from each group to observe the pathologic section, and to measure the contents of water, NO and MDA. Results The levels of water contents, NO and MDA in the sham-operated control group were all lower than that in the HIBD group (P<0.05). And the levels in the rhEPO group were lower than that in the HIBD group (P<0.01). There was no difference in the levels between the rhEPO group and the MgSO4 treated group(P>0.05).Conclusion rhEPO can protect the brain tissue of HIBD, relieve the cerebral edema, and inhibit the production free radical.
【Key words】 rat； hypoxic-ischemic brain damage；erythropoietin；cerebral edema；NO；MDA
围生期窒息所致的缺氧缺血性脑损伤(HIBD)是引起新生儿死亡或其神经系统发育障碍的主要原因。因此,积极探索安全、合理、有效的治疗方案是当今研究的热点。笔者应用促红细胞生成素治疗HIBD动物模型,观察大鼠脑组织中一氧化氮（NO）和丙二醛(MDA)水平及其对脑水肿的影响,旨在对促红细胞生成素的作用机制作进一步探讨,并为临床治疗HIBD提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 选用健康7日龄Wistar大鼠80只,体重11～16ｇ,由哈尔滨医科大学动物实验中心提供。实验动物随机分为假手术组、生理盐水对照组、EPO治疗组、硫酸镁治疗组。每组各20只。
1.2 主要药品和试剂 重组人促红细胞生成素注射液（rhEPO）［沈阳三生制药股份有限公司生产，生产批号：国药准字（2000） 沈三生 s-01号］、硫酸镁注射液［常州市第二制药厂，生产批号：国药准字（2000）011207］、NO检测试剂盒和 MDA检测试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
1.3 方法
1.3.1 模型制备 乙醚麻醉后取颈正中切口，分离并用丝线结扎右侧颈总动脉后缝合皮肤，术后恢复2h，然后置于37℃水浴且通入8％氧气和92％氮气的混合气体的密闭缺氧箱中缺氧2h，即制成缺氧缺血性脑病模型［1］。其模型检验依据脑组织的病理改变。
1.3.2 各组处理方法 假手术组只分离右侧颈总动脉，不结扎、不缺氧，亦不给予药物干预；生理盐水对照组制成模型前30min腹腔注射生理盐水0.5ml/10g；rhEPO治疗组在制成模型前30min腹腔注射rhEPO 3000u/kg；硫酸镁治疗组则给予硫酸镁100mg/kg腹腔注射。上述动物均回笼饲养，48h后断头处死，取右侧大脑半球。
1.3.3 标本的获取和结果的检测 （1）电子天平精确称量右侧大脑半球重量（湿重），将脑置于180℃恒温烤箱中烘干48h至恒重称重（干重），计算脑的含水量％＝（湿重－干重）／湿重×100％；（2）取右侧大脑半球皮质100mg，按1g∶10ml加入冰盐水作为匀浆介质，用研钵在冰水浴中研磨10min，以3000r/min的速度离心15min，取上清液，即制成10％脑组织匀浆。NO含量用硝酸还原酶法测定，MDA含量用改良的硫代巴比妥酸法测定。匀浆蛋白含量用双缩脲法测定。严格按照使用说明操作；（3）取右侧大脑半球，10％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切取中级至视交叉处组织脑组织切片(6μm),H-E染色，观察病理学改变。
1.4 统计学分析 采用方差分析，所得数据以均数±标准差（ x±s）表示，以P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 病理改变 (1)假手术组:外观显示大鼠脑膜血管无扩张,脑组织无水肿。光镜下显示脑各部位结构及层次清楚,细胞形态结构清晰完整。(2) 生理盐水对照组:肉眼见大鼠脑膜血管中度扩张,组织极度水肿。镜下显示脑各部位结构及层次紊乱,细胞水肿明显,毛细血管周围间隙增宽,神经纤维疏松。部分神经细胞固缩、细胞质深染,提示神经元变性;部分细胞嗜酸变性提示细胞坏死。（3）两干预组:外观显示大鼠脑膜血管轻度扩张,脑组织轻度水肿。光镜下显示脑各部位结构及层次较生理盐水对照组清楚,细胞轻度水肿。神经元变性及脱失较生理盐水对照组减轻。
2.2 各组脑组织含水量 与假手术组比较，生理盐水对照组脑含水量明显增加（P<0.05） ，EPO治疗组与生理盐水对照组比较，脑含水量明显减少（P<0.05），EPO治疗组和硫酸镁治疗组二者差异无显著性（P＞0.05）。表1 各组脑组织的含水量 （略）
2.3 各组脑组织的MDA和NO含量 与假手术组比较，生理盐水对照组脑皮质MDA、NO含量明显增加（P<0.05） ，EPO治疗组与生理盐水对照组比较，前者含量则明显减少（P<0.05），EPO治疗组和硫酸镁治疗组二者差异无显著性（P＞0.05）。表2 各组脑组织的MDA和NO含量 （略）
3 讨论
促红细胞生成素（EPO）一直被认为是由肾脏分泌的用于调节红细胞生成的蛋白质，是治疗肾性贫血的常规药物。近年的研究发现促红细胞生成素（EPO）和促红细胞生成素受体（EPO-R）在神经系统中也有表达［2］，在缺氧后表达增加，并且给予外源性EPO对多种脑损伤模型有脑保护作用。Morishita等培养的鼠胚海马和皮层神经置于谷氨酸中15min后再培养24h观察生存细胞，发现在置于谷氨酸之前8h经EPO处理的神经元明显被保护，而应用了可溶性EPO抗体的细胞则消除了EPO的保护［3］。与此类似，Lewczu等将培养的细胞在缺氧的同时给予EPO处理，脑神经元的死亡大大减少，能够反转低氧诱导的神经元死亡。Sadamoto等在诱导脑缺血致局部梗死的小鼠动物实验中，在脑缺血前侧脑室给予EPO治疗24h较未给药的对照组梗死灶明显减少［4］。Siren同样发现EPO能抑制低氧和红藻氨酸诱导的神经元凋亡［5］，并对EPO寄予厚望，认为EPO为神经保护提出了一个崭新的概念，为临床脑缺氧缺血的治疗提供了新的思路。
在国外不同的研究人员通过不同的动物实验和神经元体外培养证实EPO是一种神经保护因子，EPO通过直接和间接的途径发挥脑保护作用［6］,主要有以下几方面:(1)抗凋亡作用pases促进细胞存活而抑制凋亡;(2)抑制自由基的生成［7］;(3)拮抗兴奋性毒性;(4)神经营养因子的作用;(5)调节神经元的生成［8,9］；(6)诱导血管生长和新血管生成。然而，目前在国内EPO在实验动物中的保护作用研究不多，本研究就EPO对脑水肿以及脑组织中的NO、MDA含量的影响加以观察和探讨，发现缺氧缺血性脑损伤后48h脑组织的含水量、MDA、NO水平显著升高，而在应用了EPO后脑含水量和MDA、NO的升高得到了明显的遏制,接近于假手术组,表明EPO具有较强的清除氧自由基的作用,使脑内脂质过氧化反应减弱,MDA生成减少。同时抑制了NO的过量合成。本实验的病理组织学观察也显示了EPO能明显减轻脑组织的水肿和皮层神经元的坏死。
有研究证明镁离子具有神经保护作用。Marinov［10］等研究表明,脑缺血前给鼠颈动脉内注射硫酸镁,对暂时性脑缺血有强大的神经保护作用，其机制为抑制自由基的产生，拮抗兴奋性氨基酸的毒性作用，减少钙离子的内流等。本实验通过EPO及硫酸镁对缺氧缺血新生大鼠治疗后脑水肿及脑组织中MDA、NO水平的观察,发现EPO能明显改善HIBD后脑损伤，减轻脑水肿，清除自由基，具有和硫酸镁类似的作用,说明EPO不仅对培养神经元有保护作用,而且在活体动物中也有神经保护作用。这为临床上治疗脑缺氧缺血提供了新的思路。随着对EPO基础和临床研究的深入,EPO将会成为脑缺血损伤临床治疗中的重要的神经保护剂。
【参考文献】
1 吴婉芳,徐放生,张莉莉,等.建立新生儿缺氧缺血性脑病动物模型.新生儿科杂志,1992,7(6):265.
2 Magnanti M,Gandini O,Giuliani L. Erythropoietin expression in primary rat Sertoli and peritubular myoid cells.Blood,2001,98(9):2872-2874.
3 Morishita E,Masuda S,Nagao M,et al.Erythropoietin receptor is expressed in rat hippocampal and cerebral cortical neurons,and erythropoietin prevents in vitro gluta mate-induced neuronal death.Neuroscience，1997,76(1):105-116.
4 Sadamoto Y,Igase K,Sakanaka M,et al.Erythropoietin prevents placenavigation disability and cortical infarction in rats with permanent occlusion of the middle cerebral artery.Biochem Biophys Res Commun,1998,253(1):26-32.
5 Siren AL,Knerlich F,Poser W,et al. Erythropoietin and erythropoietin Receptor in human ischemic/hypoxic brain.Acta Neuro Pathol(Berl),2001,101(3):271-276.
6 王小阳.促红细胞生成素的脑保护作用. 河南医学研究，2002，11(4):372-373.
7 Calapai G,Marciano MC,Corica F,et al. Erythropoietin protects against brain ischemic injury by in hibition of nitricoxide formation.Eur J Phar Macol,2000,401(3):349-356.
8 Silva M,Grillot D ,Benito A, et al. Erythropoietin can promote erythroidprogenitor progenitor survival by repressing apoptosis through Bcl-XL and Bcl-2 Blood，1996,88(5): 1576-1582.
9 Lipton P.Ischemic cell death in brain neurons.Physiol Rev,1999(4):1431-1568.
10 Marinov MB,Harbaugh KS,Hoopes P Jack,et al.Neuro protective effect of preischemia intraarterial magnesium sulfate in reversible forcal cerebral ischemia. J Neurosurgy, 1996, 85(1):117.
作者单位： 150086 黑龙江哈尔滨，哈尔滨医科大学附属二院儿内科
(编辑：俊 红)