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【摘要】 目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV)在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样病变（CIN）及浸润性宫颈癌（ICC）中的表达，旨在提高宫颈上皮内瘤样病变及浸润性宫颈癌的诊断率。方法 采用原位杂交（HCⅡ）方法检测40例慢性宫颈炎、30例CINⅠ～Ⅱ、25例CINⅢ以及30例ICC病例中高危HPV的表达。结果 高危HPV感染与CIN及ICC关系密切，慢性宫颈炎、CINⅠ～Ⅱ组织几乎不表达HPV，显著低于CINⅢ ICC，差异有显著性（P<0.05)。结论 检测高危HPV是早期诊断CIN Ⅲ及ICC的一个重要辅助方法，并有助于探讨CIN及ICC的发病机制。
【关键词】 乳头状瘤病毒，人；宫颈上皮内瘤样病变；宫颈肿瘤
Clinical analysis on the expression of HPV in the cervical carcinoma and its precancerous lesions
JIANG Xing，LI Ji-hong，SHI Yu-hua，et al.Department of Obstetrics and Gynecology，Maternity & Child care Hospital of Zhuhai，Zhuhai 519000，China
【Abstract】 Objective The purpose of this research was to explore the expression of human papilloma virus(HPV) in the chronic cervicitis，cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and invasive carcinoma of cervix(ICC)，with aim to improve the the pre-operative diagnosis of CIN and ICC.Methods In situ hybridization technique was employed to study the expression of HPV in 40 cases of the chronic cervicitis，30 cases of CIN Ⅰ～Ⅱ，25 cases of CINⅢ and 30 cases of ICC.All samples were detected with HE stain.Results The high risk HPV infection in the cervical tissue was closely related to the CIN and ICC，the expression of high risk HPV in the chronic cervicitis and CINⅠ-Ⅱ was little and remarkably lower than that of CIN Ⅲ and ICC，the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion It is an important auxiliary way to evaluate the CIN and ICC by detecting the high risk HPV in cervical swear sample applying HCⅡ technique because of he high expression of high risk HPV，It is useful to study the mechanism and to improve the diagnosis of CIN and ICC by detecting the expression of HPV.
【Key words】 papilloma virus，human；cervical intraepithelial neoplasia；cervix neoplasms
人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV)感染与宫颈上皮内瘤样病变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宫颈癌（invasive carcinoma of cervix，ICC)的发生、发展密切相关，它影响着CIN和ICC中的病理分类和临床治疗［1］。HPV在CIN和ICC的作用，是当前研究的热点之一［2］。本研究旨在探讨我院近几年来门诊和住院患者中HPV的表达与CIN和ICC关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2003年1月～2006年1月就诊于我科门诊及住院患者，年龄19～62岁，平均38.6岁。分为4组：第1组，慢性宫颈炎患者作为对照组，共40例，均为门诊妇检患者；第2组，CINⅠ～Ⅱ组，共30例；第3组，CINⅢ组，共25例；第4组，浸润性宫颈癌组，共30例，11例发生盆腔淋巴结转移。各组术前均未行放疗、化疗或半年内未经过激素治疗。
1.2 方法
1.2.1 实验设备 美国Digene公司的微孵育系统、杂交捕获系统，上海精密科学仪器有限公司的721分光光度计，上海医用恒温设备厂的GH—8D型电恒温水槽。
1.2.2 检测方法 美国Digene公司提供的专用HPV取样器，插入子宫颈外口，顺时针或逆时针转动5圈，慢慢取出取样器放入标有受试者编码的含有保存液的小瓶中，置-20℃冰箱冻存，随后送我院实验室进行检查。HPV DNA的检测操作步骤：（1）碱性溶液破坏病毒使DNA双链被释放并分解为核苷酸单链；（2）DNA单链与RNA探针结合为RNA-DNA杂交复合物；（3）第一抗体（特异性抗体）将RNA-DNA杂交复合物固定在微孔壁上；（4）结合有碱性磷酸酶的多个第二抗体与RNA-DNA杂交复合物结合，使信号放大；（5）碱性磷酸酶使酶底物发光，判读光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA的含量。HCⅡ采用96孔平板法，可一次性检测13种高危型HPV（16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68）。
1.2.3 结果判定 诊断阳性指标定为标本中检出的HPV DNA≥1.0pg/ml。两份标本的检测结果中一项阳性即认作感染阳性。
1.3 统计学方法 统计学软件采用SPSS 13.0进行χ2检验，检验水准α=0.05。
2 结果
高危型HPV在慢性宫颈炎组、CINⅠ～Ⅱ组、CINⅢ组以及ICC组中的阳性率分别为0、23.3%、48.0%及76.7%，可见在各组的阳性表达率逐渐升高（表1）。ICC组高危型HPV阳性率明显高于CINⅠ～Ⅱ组与慢性宫颈炎组，差异有显著性（P=0.000），而与CINⅢ组相比差异亦有显著性（P=0.028）；CINⅢ组与CINⅠ～Ⅱ组相比差异无显著性（P=0.055），与慢性宫颈炎组相比差异有显著性（P=0.000）；CINⅠ～Ⅱ组与慢性宫颈炎组相比差异有显著性（P=0.005）。表1 4组病例中高危型HPV的阳性表达情况注：与对照组（慢性宫颈炎组）比较，*P<0.01
3 讨论
随着宫颈癌各种筛查方法和技术的发展，宫颈癌在世界范围内的发生率呈下降趋势，但在我国其发生率仍居女性恶性肿瘤的首位，是导致妇女死亡的主要原因。CIN及ICC的发生、发展受多种因素调控，宫颈局部感染是高危因素之一。Zur Hausen［3］在1977年首先提出HPV是宫颈癌致病因素的假设，他在总结宫颈癌病毒病因时提出启动因子协同HPV致病的发病机制，HPV检测的意义愈来愈受到人们的关注。持续性高危型HPV感染是宫颈癌前病变和宫颈癌发生发展的高危因素。国内也有很多学者进行了相关研究，认为HPV在宫颈癌发生中起重要的作用。目前已鉴定出HPV亚型100余种，其中HPV16、18、33等与宫颈癌的发生发展密切相关，称为高危型。其早期基因E6和E7不仅可直接转化细胞，还与细胞周期调控蛋白相互作用，干扰正常细胞周期调控，导致细胞无限制生长，引起癌变，是HPV致癌的主要机制［4］，因而被认为是癌基因。Zur Hausen(1982)在总结宫颈癌病毒病因时提出启动因子协同HPV致病的发病机制，即在启动因子的反复作用下，促使HPV感染后宫颈上皮发生不典型增生以致宫颈癌的形成。一般认为HPV基因组合到宿主细胞染色体上，并激活相应的致癌基因。病毒转化蛋白与细胞抑癌基因产物使宿主P53或PRB蛋白失活，导致细胞生长失控，细胞周期紊乱，从而产生肿瘤细胞［5］。本研究结果显示，高危型HPV在ICC、CINⅢ级、CINⅠ～Ⅱ级及慢性宫颈炎的宫颈管分泌物总阳性率分别达76.7%、48.0%、23.3%、0，提示高危型HPV是宫颈癌致病的重要因素。间接说明预防性传播疾病即预防HPV感染是预防宫颈癌发生的重要措施之一。建议对慢性宫颈炎患者除常规宫颈刮片筛选外，宜行宫颈分泌物高危型HPV检测，从而早期筛选出高危人群，积极治疗和定期随访，预防肿瘤发生。
目前，宫颈癌前病变的初筛通常是通过宫颈涂片的细胞学检查来完成，它存在的最大弊端是假阴性率较高（15%～40%），主观性较强。而运用液基细胞学和计算机辅助细胞学分析法（CCT）系统进行筛查可降低假阴性，但需要有经验的细胞学病理技术人员和一定的医疗设备，成本较高。HCⅡ则避免了这些问题，该方法是由美国Digene公司开发、获得美国食品药品管理局唯一批准的、用于临床非放射性检验HPV DNA的新技术。有高危型和低危型两种探针。它可灵敏地检出高危宫颈病变和癌症，尽管假阳性率较细胞学高，但方法简便、重复性好、客观性强，目前的96孔平板法可一次检测90人，大大提高了工作效率，适于作为大人群的初筛手段。本研究中也采用了该方法检测HPV。目前，欧洲某些国家已推荐用HCⅡ检测HPV与细胞学检查联合对大规模人群进行宫颈癌和癌前病变的筛查，为临床医生提供更具有选择性和经济效益的随访计划［6］。在用HPV检测筛查宫颈癌时还要注意HPV的流行是因人群而异，年轻妇女的感染通常为一过性，只有高危型HPV持续感染，其患宫颈癌的危险性才会增加。
HPV的致瘤作用与HPV DNA的整合有关。HPV感染宿主细胞后以游离状态引起细胞的感染，首先潜伏于基底细胞层，其DNA作为主要的外源染色体游离于细胞核内，病毒核酸整合到宿主细胞内，使宿主细胞发生突变，发展为癌。研究表明，HPV16，18型DNA均呈整合形式。目前认为，整合后的DNA发生致癌作用的主要基因为E6、E7和E2［7］。在HPV感染的上皮细胞中环状HPV病毒通过E1、E2的开放读码框断开并线性化，插入到人体上皮细胞的染色体上，E2 ORFs的断裂可导致E2基因的丢失或失活。E2蛋白是一种特异性DNA束缚蛋白，它可以调节病毒mRNA的转录及DNA的复制。E6、E7的转化作用亦受E2的调控，E2片段的缺失可导致E6和（或）E7基因表达失控，引起细胞的转化或癌变［8］。致癌基因E6、E7在直接转化细胞的同时，还可与细胞周期调控蛋白相互作用，干扰正常的细胞周期调控，从而导致细胞无限制生长，引起癌变。E6、E7不仅能结合感染的宿主细胞DNA，还可与抑癌基因P53结合，降低P53的抑癌功能，促进细胞的转化和癌细胞的发生。
HPV感染后可以引起宫颈组织发生瘤样病变，甚至癌变［9］。Cuzick等［10］对2009例宫颈涂片正常的妇女进行高危型HPV筛查，88例阳性者在3年内进展到CINⅢ，高危型HPV阳性进展为CINⅢ者是阴性的者的16倍。Schiffman等［11］的研究指出，宫颈HPV阴性的亚临床感染者，在1年内约有1/3可发展为CIN，而高危型HPV感染者有15%的病例向CINⅢ或宫颈癌方向发展。而最近由Bratti等［12］对10049例18～97岁HPV感染阳性者随访7年所得资料显示，虽然HPV阳性者发展为CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌的比例较低，但有细胞学异常、不良性行为、合并其他生殖道病毒感染者宫颈病变或恶变的比例则较高。可见HPV感染，特别是高危型HPV感染是导致宫颈癌和CIN高度病变的原因之一，尤其在宫颈组织受到侵害的情况下表现更为突出，但不忽视HPV感染以外的其他病因或协同因素的存在［12］。本研究CINⅢ及ICC组的55例中，仅有35例是高危型HPV持续阳性，而5个高危型HPV阴性病例亦为宫颈癌，可见除高危型HPV感染以外仍有其他病因及协同因素的存在。
总之，宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，HPV感染是导致宫颈癌以及宫颈上皮内瘤变的重要因素之一。在CIN及ICC中运用原位杂交HCⅡ法检测高危HPV是早期诊断CINⅢ及ICC是一个重要辅助方法，并有助于探讨CIN及ICC的发病机制。
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10 Cuzick J，Szareqsky A.Terry G，et al.Human papillomavirus testing in primary cervical screening.Cancer，1995，347(6)：1533-1536.
11 Schiffman MH，Bauer HM，Hoover RN，et al.Epidemiologic evidence showing that human papillomavirus infection causes most cervical intraepithelial neoplasia.J Natl Cancer Inst，1993，85(3)：958-964.
12 Bratti MC，Rodriguez AC，Schiffman M，et al.Description of a seven-year prospective study of human papillomavirus infection and cervical neoplasia among 10000 women in Guanacaste，Costa Rica.Rev Panam Salud Publica，2004，15(2)：75-89.
*基金项目：广东省珠海市卫生局资助项目（项目编号：2004023）
作者单位： 519000 广东珠海，珠海市妇幼保健院妇产科（△病理科）
(编辑：江 枫)