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【摘要】 目的 探讨单独应用促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin-releasing hormone agonist,GnRHa)及与顺铂联合应用对卵巢癌裸鼠移植瘤化疗效果的影响及其分子机制。方法 将24只裸鼠腹腔种植低分化卵巢浆液性囊腺癌细胞株OVCAR-3，成瘤后随机分为4组，即对照组(NS)、顺铂组、GnRHa组(GnRHa+NS)、联合用药组(GnRHa+顺铂)。剥取肿瘤组织称重，透射电镜检测各组肿瘤组织中细胞凋亡情况，免疫组织化学法检测肿瘤组织中ki67、NFkb及caspase-3表达水平。结果 对照组中未见到明显凋亡细胞及凋亡小体;顺铂组以核边集固缩的早期凋亡细胞为主;GnRHa+NS组可见凋亡细胞及坏死溶解细胞;联合用药组以中晚期凋亡细胞为主。肿瘤重量及ki67评分：对照组分别为(0.149±0.072)g、(9.533±2.380);顺铂组(0.034±0.010)g、(6.283±0.491);GnRHa组(0.116±0.039)g、(8.733±0.531);联合用药组(0.026±0.024)g、(7.70±0.745)。统计结果，顺铂组和联合用药组肿瘤重量及ki67分别与对照组相比，差异有显著性(P<0.05);而GnRHa组与对照组肿瘤重量及ki67比较、顺铂组和联合用药组肿瘤重量及ki67比较差异均无显著性(P>0.05)。顺铂组与联合用药组肿瘤重量及ki67均明显低于其余两组，差异有显著性(P<0.05);与对照组比较，顺铂组、GnRHa组、联合用药组NFkb表达减弱，caspase-3表达增强，差异均有显著性(P<0.05)。联合用药组NFkb表达量比顺铂组减少，差异具有显著性(P<0.05)。结论 单独应用GnRHa不影响肿瘤细胞的增殖;联合应用GnRHa及顺铂不影响顺铂对卵巢癌细胞的抗增殖作用;单独应用GnRHa、顺铂及GnRHa与顺铂联合应用均能诱导卵巢癌裸鼠移植瘤肿瘤细胞的凋亡。下调NFkb表达、上调caspase-3表达可能为诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制之一。
【关键词】 卵巢肿瘤;促性腺激素释放激素激动剂;顺铂;细胞凋亡
Chemotherapy effects of GnRHa and cisplatin in ovarian cancer model of athymic mice and their molecular mechanism
WENG Hui-nan,WANG Yi-feng,LIN Qiong-yan. Department of Obstetrics and Gynecology,Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College,Guangzhou 510150,China
objective To explore the anti-proliferation and apoptosis inducing effects of GnRHa ,cisplatin or both on the ovarian cancer model of athymic mice and their related molecular mechanisms.Methods Twenty-four nu/nu athymic mice were injected intraperitoneally with human ovarian serous cystadenocarcinoma cells of the line OVCAR-3 and then randomly divided into 4 groups:control group (n=6,used as controls),CDDP group (n=6,receiving NS 0.2ml after inoculation, CDDP 4 weeks after 2 weeks of the injection of NS),GnRHa group(n=6,receiving GnRHa + NS) and GnRHa + CDDP group(n=6,receiving GnRHa + CDDP). At the end of the experiment,mice were killed,and the tumor tissue was excised and histochemical analysis.Transmissino electron microscopy detect the apoptosis of the tumor tissue . The protein levels of ki67,NFkb and caspase-3 in the tumor tissue was detected by immunohistochemistry.Results There was no apoptosis cell or apoptosis body in control group.The viable apoptotic cells were observed in the cisplatin group.Apotosis cells and necrosis dissolve cells were seen in GnRH a+NS group.In combined group there were mid and non-viable apoptotic cells. The immunohistochemistryscore of ki67 and the weight of the ovarian cancer of the CDDP group and the combination group were lower than the control group and the GnRHa group,but there were no significantly difference between the CDDP group and the combination group(P>0.05).Compared with the control group,the protein level of NFkb was decreased while caspase-3 expression was increased in the other three groups(P>0.05).The level of NFkb in combined group was lower than the group of cisplatin,which had significantly difference (P<0.05).Conclusion GnRHa combined with CDDP in the nu/nu athymic mice ovarian cancer model do not influence the anti-proliferation of CDDP to the ovarian cancer.GnRHa ,cisplatin or both of them could also induce the apoptosis through up-regulating caspase-3 and down-regulating expression of NFkb on the ovarian cancer model of athymic mice,which probably one of its molecular mechanisms.
[Key words] ovarian cancer;gonadotropin-releasing hormone agonist;cisplatin;anti-proliferation apoptosis
卵巢癌目前仍为女性恶性肿瘤死亡率最高的疾病，且发病年龄日趋年轻化。传统手术治疗、放化疗及生物治疗等治疗措施疗效有限，不良反应大，5年生存率徘徊在30%左右。目前有报道在肿瘤化疗过程中，使用GnRHa有卵巢功能保护的作用。而顺铂是卵巢癌标准化疗方案的用药之一。目前尚未有研究联合使用GnRHa及顺铂对肿瘤细胞化疗的相关影响。在体外实验方面，有研究证实GnRHa能直接抑制卵巢癌细胞增殖[1]，并呈时间剂量依赖性[2，3]。而在凋亡方面，GnRHa是否能诱导肿瘤细胞凋亡，与顺铂联合用药是否有协同作用尚未清楚。本研究拟建立卵巢癌裸鼠移植瘤模型，探讨体内单独应用GnRHa、GnRHa与顺铂联合应用对卵巢癌裸鼠移植瘤模型肿瘤细胞凋亡及增殖的影响及可能的分子机制。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞株和裸鼠 人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株OVCAR-3购自中国科学院细胞库，4～6周龄成年雌性BALB/c-nu裸鼠24只，体重14～16g。购自广东省医学实验动物研究中心[动物许可证号：SYXK(粤)2005-0058]，中山大学眼科中心SPF实验动物部饲养，恒温(25±2)℃，恒湿45%～50%，饲养于无菌实验室的净化空气层流架中。顺铂(CDDP)为齐鲁制药厂产品;醋酸曲普瑞林(达菲林)为博福-益普生(天津)制药有限公司产品;高糖型DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清为美国GIBCO公司产品;免疫组化试剂(北京中杉金桥)一抗为NFkb抗体及caspase-3抗体(广州杰特伟生物科技有限公司)。选择即用型免疫组化(IHC)二步法染色试剂盒(北京中杉金桥);透射电镜型号为日本电子株式会社(JELO100CX)。
1.2 细胞培养 人卵巢癌细胞株OVCAR-3在高糖型DMEM培养基中培养至对数生长期，0.25%胰蛋白酶消防立管化3min，终止反应，制备成单细胞悬液，细胞计数，调整细胞密度为2×107/ml。
1.3 动物接种及实验分组 在SPF环境超净工作台内，以75%酒精消毒裸鼠腹部皮肤，腹腔接种0.2ml细胞悬液，观察动物成瘤情况，接种后第10天可观察到裸鼠腹部稍膨隆，活动减少，腹腔进针处可见米粒样大小结节。腹腔肿瘤原代培养细胞形态与OVCAR-3细胞形态一致。遂将24只裸鼠随机分为4组每组6只：即对照组[腹腔注射生理盐水(NS)0.2ml/w×5w]、顺铂组(第一天腹腔注射NS 0.2ml,2周后腹腔注射顺铂5mg/w×4w)、GnRHa+NS组(GnRHa 0.3mg皮下注射，2周后NS 0.2ml/w腹腔注射×4w)、联合用药组(GnRHa 0.3mg皮下注射，2周后顺铂腹腔注射5mg/w×4w)。
1.4 观察指标
1.4.1 裸鼠肿瘤、卵巢病理学检查 用药结束后脱颈法处死各组裸鼠，剥离肿瘤组织,称重。PBS洗净血污后置于中性甲醛固定，脱水，石蜡包埋后4μm连续切片，HE染色，在光学显微镜下进行组织学观察。
1.4.2 透射电镜标本制备并观察肿瘤组织细胞凋亡情况 4%戊二酸、1%锇酸双固定，包埋，聚合，超薄切片，醋酸铀枸橼酸铅双重染色，日本电子株式会社(JELO100CX)透射电镜观察。
1.4.3 肿瘤组织增殖抗原ki67检测 取石蜡标本，切片，二步法(IHC)行ki67免疫组织化学染色。所有照片在相同光线及显微条件下拍摄，随机取5个高倍视野，计数阳性细胞数对ki67的表达阳性率进行评分，标准按：0(-)评1分;0～25%(+)评2分;25%～50%(++)评3分;50%～75%(+++)评4分;75%～100%(++++)评5分。对细胞阳性强度进行评分，标准按：阴性：无棕黄色染色，评1分;弱阳性：胞核淡棕黄色染色，评2分;中度阳性：胞核棕黄色染色，评3分;强阳性：胞核深棕黄色染色，评4分。评价各组裸鼠肿瘤组织ki67表达情况用特异指数总细胞免疫染色评分(TISS)表示，TISS=阳性率×阳性强度，分数在1～20分之间。
1.4.4 肿瘤组织半胱胺酸蛋白酶蛋白-3(caspase-3)及NFkb检测 取石蜡标本，切片，按照试剂盒说明书二步法(IHC)行caspase-3及NFkb免疫组织化学染色。结果判断：光学显微镜下caspase-3及NFkb表达阳性细胞的胞浆内呈现特异性棕褐色。所有照片在相同光线及显微条件下拍摄，随机取5个高倍视野。运用免疫组化图像分析软件Image-pro plus 6.0分析平均光密度(MOD)=积分光密度(IOD)/图片面积(Sum area)。
1.5 统计学处理 数据以(x±s)表示，运用SPSS13.0统计软件处理，方差不齐者用Welch法分析，方差齐者用单因素方差分析，各组间的两两比较采用LSD法。
2 结果
2.1 卵巢癌裸鼠移植瘤成瘤情况及HE染色病理学检查结果 裸鼠腹腔接种后第10天可观察到腹部稍膨隆，活动减少，腹腔进针处可见米粒样大小结节，成瘤率96%。病理学检查结果：肿瘤组织呈团块状，侵犯脂肪组织及横纹肌组织;细胞核核浆比例增大，细胞浆透明空泡状，部分红染;细胞核呈卵圆或不规则形，见有核仁，顺铂、GnRHa及GnRHa+顺铂组中均可见散在凋亡细胞(见图1、2)。
图1 HE染色;10×10。肿瘤组织呈团块状，侵犯脂肪组织中;细胞核核浆比例增大，细胞浆透明空泡状，部分红染。细胞核呈卵圆或不规则形，见有核仁，并可见散在凋亡细胞(箭头所示) 图2 HE染色;10×10。肿瘤组织呈团块状，侵犯横纹肌组织中;细胞核核浆比例增大，细胞浆透明空泡状，部分红染。细胞核呈卵圆或不规则形，见有核仁，并可见散在凋亡细胞(箭头所示)2.2 透射电镜观察 对照组未见有凋亡细胞(见图3)。而在顺铂、GnRHa、GnRHa+顺铂组处理后凋亡肿瘤细胞的形态改变包括：胞质浓缩，细胞核深染，染色质浓缩成块并边集，其中以早、中、晚期凋亡为最具特征性改变。细胞凋亡早期,细胞核染色体发生边集,核形不规整,核膜表面凹凸;凋亡中期,核内染色质凝聚,趋边呈月牙状,核膜孔消失,核膜呈波纹状皱缩;凋亡晚期,核固缩,细胞膜出芽形成小泡,可见凋亡小体。顺铂组以核边集固缩的早期凋亡细胞为主;GnRHa组可见凋亡细胞及坏死溶解细胞;联合用药组以中晚期凋亡细胞为主(见图4、5、6)。
2.3 各组裸鼠肿瘤组织重量及增殖抗原ki67免疫组化评分 4组裸鼠肿瘤组织重量及增殖抗原ki67免疫组化评分见表1。经统计分析，顺铂组及联合用药组此两项指标均明显低于其余两组，差异有显著性(P<0.05);而顺铂组与联合用药组比较差异无显著性(P>0.05);对照组与GnRHa组比较，差异无显著性(P>0.05)。
图3 对照组未见有凋亡细胞 图4 顺铂组可见核边集固缩的早期凋亡细胞图5 GnRHa组可见坏死溶解细胞 图6 GnRHa+顺铂组可见中晚期凋亡细胞表1 4组裸鼠肿瘤重量及ki67免疫评分情况注：与对照组比较，*P<0.05
2.4 各组肿瘤组织半胱胺酸蛋白酶蛋白-3(caspase-3)及NFkb表达的影响 顺铂组、GnRHa组、联合用药组NFkb表达下调，caspase-3表达上调,与对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)。数据见表2。联合用药组NFkb表达量比顺铂组减少，差异具有显著性(P<0.05)。表2 4组裸鼠NFkb 及caspase-3的表达注：顺铂组、GnRHa组、联合用药组分别与对照组比较，*P<0.05;联合用药组与顺铂组比较，#P<0.05
3 讨论
目前GnRHa已经广泛应用于激素依赖性肿瘤如乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等的治疗，其理论依据是GnRHa抑制垂体促性腺激素FSH、LH的分泌，从而使雌激素分泌减少而起到治疗作用。研究表明，80%卵巢癌细胞存在GnRH受体，卵巢肿瘤细胞能自分泌或者旁分泌GnRH[3,4]，有体外研究表明，GnRHa通过影响Fas配体-Fas系统诱导细胞凋亡[5，6]。本实验研究在卵巢癌裸鼠移植瘤模型体内应用GnRHa是否影响肿瘤细胞的增殖和凋亡，NFkb和caspase-3这两个与细胞凋亡信号转导有关的关键分子是否参与GnRHa及GnRHa联合顺铂对肿瘤细胞的作用。
3.1 GnRHa对顺铂抑制卵巢癌裸鼠移植瘤细胞增殖的影响 已有实验研究表明GnRHa对顺铂化疗引起的卵巢功能损害具有保护作用，但合用GnRHa是否影响化疗药物的治疗效果则研究甚少。直到2005年袁光文等[7]对卵巢癌大鼠模型的研究，发现GnRHa不影响CTX的化疗效果。但该研究仅从大鼠生存时间观察GnRHa对CTX化疗效果的影响，未从细胞增殖及凋亡等方面检测验证。
本研究利用OVCAR-3细胞株在BALB/c-nu裸鼠上建立卵巢癌裸鼠移植瘤模型[8,9]，对其进行顺铂腹腔化疗及顺铂联合应用GnRHa，通过检测ki67从细胞增殖方面研究GnRHa对顺铂化疗效果的影响。刘培淑等[10]研究显示ki67与卵巢癌肿瘤大小、临床分期及预后相关。美国学者Makris等[11]在化学内分泌治疗过程中通过细针抽吸细胞，检测ki67的增殖指数及雌孕激素受体，认为ki67是与临床反应相关的细胞增殖标记物。本研究表明，GnRHa组、顺铂组和联合用药组ki67分别与对照组相比，差异有显著性;而GnRHa组与对照组ki67比较，顺铂组和联合用药组ki67比较差异均无显著性。说明体内单用GnRHa不影响肿瘤细胞的增殖;而顺铂治疗及联合治疗卵巢肿瘤都是有效的，且合用GnRHa并不影响顺铂对肿瘤细胞的抗增殖作用，即不影响顺铂对卵巢癌裸鼠移植瘤模型的化疗效果。
3.2 GnRHa对卵巢癌裸鼠移植瘤顺铂诱导细胞凋亡的影响及可能的分子机制 本研究显示，在卵巢癌裸鼠移植瘤模型体内单独应用GnRHa及GnRHa联合顺铂均能诱导肿瘤细胞凋亡：(1)GnRHa组、顺铂组和联合用药组HE染色病理学检查均可见散在细胞凋亡，而对照组病理学检查未见细胞凋亡。(2)透射电镜形态学检查结果显示：所诱导的凋亡肿瘤细胞，在顺铂组以核边集固缩的早期凋亡细胞为主;GnRHa组可见坏死溶解细胞;而联合用药组以中晚期凋亡细胞为主。
NFkb参与许多基因调控，与免疫反应、细胞粘附、分化、增殖、血管生成及凋亡密切相关;NFkb及其抑制物IkappaB之间的失衡与许多疾病，包括肿瘤的发生有密切关系[12]。而细胞分化、增殖、血管形成及凋亡在肿瘤发生发展起到关键作用。本研究表明体内单独应用GnRHa及GnRHa联合顺铂后，NFkb蛋白表达均比对照组有下调，而对caspase-3蛋白表达则有上调作用。单独应用GnRHa、GnRHa联合顺铂能抑制NFkb的表达，可导致体内许多细胞增殖关键性基因转录降低、凋亡相关基因转录上调。NFkb的表达联合用药组与顺铂组对比差异有显著性，从侧面显示联合用药组抑制NFkb的表达更明显。由此考虑抑制NFkb的表达可能是GnRHa及GnRHa联合顺铂诱导卵巢肿瘤细胞凋亡的分子机制之一。
Caspase蛋白酶在死亡受体介导的细胞凋亡中起着中心的作用。Caspase家族通过靠近天冬氨酸残基位置的切割作用，使得caspase家族成员以类似于酶原激活的方式相互激活，并形成级联放大效应。Caspase家族可分为三个组，分别以caspase-1、caspase-2和caspase-3为代表。其中最重要的是caspase-1、caspase-3 和caspase-8。Caspase-3 通过激活DNase、酶切PARP片段化、降解细胞骨架蛋白及一些癌蛋白等机制[13]，使细胞赖以生存的关键物质不可逆性破坏，最终导致细胞凋亡。其中caspase-8是这一凋亡过程中首先被活化的ICE家族蛋白酶，caspase-8活化后，可以剪切活化caspase-3、caspase-7、caspase-4、caspase-9和caspase-10，通过这些蛋白酶剪切底物使凋亡得以进行。研究显示[14]，NFkb与凋亡信号转导通路中caspase-8、caspase-3等蛋白分子间关系密切。本研究表明单独应用GnRHa及GnRHa联合顺铂可能通过激活凋亡效应分子caspase-3，使其表达升高，从而诱导卵巢肿瘤细胞的凋亡。从而推测单独应用GnRHa及GnRHa联合顺铂可能通过抑制NFkb的表达，使凋亡蛋白caspase-8、caspase-3等表达上调，最终诱导肿瘤细胞凋亡。
综上所述， 联合应用GnRHa与顺铂并不影响顺铂对卵巢癌裸鼠移植瘤细胞的抗增殖作用。单独应用GnRHa、顺铂及GnRHa与顺铂联合应用均能诱导卵巢癌裸鼠移植瘤细胞的凋亡。而下调NFkb表达、上调Caspase-3表达可能为诱导凋亡的分子机制之一。而在卵巢癌裸鼠移植瘤模型中单独应用GnRHa及GnRHa联合顺铂在诱导肿瘤细胞凋亡量上差异有显著性，GnRHa与顺铂在诱导肿瘤细胞凋亡方面是否有协同作用，还需要进一步的实验研究。随着研究的深入，相信GnRHa除了在保护化疗患者卵巢功能方面起重要的作用外，还能作为一种抗肿瘤的辅助药物，展现其广阔的应用新前景。
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