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【摘要】 目的 通过检测宫颈癌及其癌前病变组织中DNA结合抑制因子-1(Id-1)蛋白和mRNA的表达情况，探讨Id-1在宫颈癌变过程中的作用。方法 采用免疫组化SP法检测Id-1蛋白在15例慢性宫颈炎、17例CINⅠ、25例CINⅡ～Ⅲ和79例宫颈癌组织中的表达;采用实时荧光定量RT-PCR法检测Id-1 mRNA在10例慢性宫颈炎、8例CINⅠ、9例CINⅡ～Ⅲ和8例宫颈癌组织中的表达。结果 慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宫颈癌组织中Id-1蛋白表达阳性率呈逐渐升高趋势(P<0.01)，分别为0、11.8%、40.0%、74.7%;CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌组织中Id-1 mRNA的相对表达量分别是慢性宫颈炎组织的1.34倍、3.42倍和10.37倍，随宫颈癌变程度加重Id-1基因表达增加(P<0.05)。结论 随着宫颈癌变程度加重，Id-1表达逐渐增加，表明Id-1可能参与了宫颈癌的发病机制。
【关键词】 宫颈癌;宫颈上皮内瘤变;Id-1;DNA结合抑制因子-1;实时荧光定量RT-PCR
Objective To investigate the effect of the inhibitor of DNA binding-1(Id-1)in the process of carcinogenesis of cervical cancer by detecting the expression of Id-1 protein and mRNA in the cervical cancer and its precancerous lesions.Methods The expressions of Id-1 protein in 15 chronic cervicitis, 17 CINⅠ, 25 CINⅡ-Ⅲ and 79 cervical squamous cancers were assessed by immunohistochemical SP methods. Real-time fluorescence quantitative RT-PCR (QRT-PCR) was used to detect the expression level of Id-1 mRNA in 10 chronic cervicitis, 8 CINⅠ, 9 CINⅡ-Ⅲ and 8 cervical squamous cancers respectively.Results It was found that the expression level of Id-1 protein followed this pattern: cervical cancer > CINⅡ-Ⅲ > CINⅠ> chronic cervicitis (P<0.01), and the positive expression rate of Id-1 protein was 74.7%, 40.0%, 11.8%and 0.0% respectively. The relative amount of Id-1 mRNA expression in CINⅠ, CINⅡ-Ⅲ and cervical cancer is respectively 1.34 times, 3.42 times and 10.37 times of that in the chronic cervicitis, which indicates that the Id-1 mRNA expression increases with the proceeding of cervical affection.Conclusion The Id-1 expression was increased with the aggravation of cervical lesions. It suggests that Id-1 might have participated in the pathogenesis of cervical squamous cell carcinoma.
[Key words] cervical cancer; CIN; Id-1; inhibitor of DNA binding-1; real-time fluorescence quantitative RT-PCR
近年研究发现，DNA结合抑制因子-1(Id-1)作为一种转录调节因子在多种上皮来源的恶性肿瘤中表达升高，并且与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡及血管生成等有关[1]。目前对Id因子与宫颈癌的相关研究国内外仅见一篇报道，即Schindl等[2]的研究，但对Id-1在宫颈癌变过程(慢性宫颈炎CINⅠCINⅡ～Ⅲ→宫颈癌)中的研究尚未见报道。为此笔者采用免疫组化SP法和实时荧光定量RT-PCR法，首次定性与定量研究Id-1蛋白和mRNA在慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌组织中的表达，初步探讨Id-1在宫颈癌发生发展中的作用及意义，为宫颈癌的病因学研究和基因靶向治疗提供一个新线索。
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 免疫组化
选取我院病理科保存的2004-2009年宫颈癌变相关组织石蜡标本136例，患者年龄23～68岁，平均(42.56±8.20)岁。依据病理表现分四组，即慢性宫颈炎组15例、CINⅠ组17例、CINⅡ～Ⅲ组25例、宫颈癌组79例。所有标本均由≥2名的病理学专家再次阅片确诊。选定的石蜡标本均经中性甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片。
1.1.2 实时荧光定量RT-PCR
经伦理委员会批准并取得患者知情同意后，选取2008年10月-2009年10月在我院行宫颈活检或子宫切除术的患者作为本研究对象。所有患者术前均未接受放、化疗或手术治疗。所取新鲜组织标本大小约0.5cm×0.5cm×0.5cm，液氮保存备用。最后根据病理结果纳入慢性宫颈炎组10例、CINⅠ组8例、CINⅡ～Ⅲ组9例、宫颈癌组8例，共35例，年龄26～57岁，中位年龄37岁。阳性对照为卵巢癌1例，年龄55岁。
1.2 实验方法
1.2.1 免疫组化SP法检测Id-1蛋白的表达
(1)一抗Id-1兔抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，免疫组化SP超敏试剂盒为天津津脉基因测绘技术有限公司产品。具体实验步骤按照说明书进行。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照，阳性对照由Santa Cruz公司提供。(2)采用Olympus光学显微镜观察各试验组宫颈组织中Id-1表达情况，由2名试验人员双盲法独立分别对试验结果进行半定量评分，最终结果取均值或协商确定。Id-1免疫组化阳性着色主要定位于胞浆，为棕黄色或棕褐色。根据着色深浅和阳性细胞比例对免疫组化结果进行半定量评分，确定表达强度分级。具体评分标准见参考文献[2]。
1.2.2 实时荧光定量RT-PCR检测Id-1 mRNA的表达
(1)Trizol提取组织总RNA，-70℃保存备用。(2)Id-1和β-actin基因引物和TaqMan探针由TaKaRa公司合成，见表1。(3)Id-1基因为单外显子，逆转录前用DNA酶处理。按照Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(立陶宛MBI 公司)说明书进行操作，逆转录获得cDNA。逆转录条件为20℃ 10min → 42℃ 60min → 70℃ 10min，-20℃保存备用。(4)标准曲线的制备：用假定初始拷贝数(X)的cDNA模板按10倍梯度进行稀释，自每个稀释模板中取样2μl，分别加入30μl的反应体系中行实时荧光定量RT-PCR。扩增条件为94℃预变性2min;94℃ 20s，54℃(Id-1)/52℃(β-actin)20s，60℃ 30s，45个循环;最后60℃延伸5min。将PCR仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期，在该时相读取Ct值。(5)待测样本目的基因相对拷贝数的测定：将逆转录得到的cDNA样品各取2μl，加入和上面完全相同的反应体系，在同样的反应条件下行PCR扩增，测定各样品的Ct值，采用比较阈值法计算目的基因拷贝数=2-ΔΔCt，ΔΔCt=(CtId-1-Ctβ-actin)试验组-(CtId-1-Ctβ-actin)参照组。本研究目的基因为Id-1，管家基因为β-actin，参照组为慢性宫颈炎组。2-ΔΔCt表示的是试验组目的基因的表达相对于参照组的变化倍数。表1 Id-1和β-actin基因引物及探针序列
1.3 统计学分析 应用SPSS13.0软件系统对所得数据进行统计学处理，检验水准取双侧α=0.05。统计方法包括χ2检验、单向方差分析(One-way ANOVA)。
2 结果
2.1 Id-1蛋白在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达 慢性宫颈炎组织中未见Id-1蛋白阳性表达，而宫颈癌及癌前病变组织中均有不同程度的Id-1免疫阳性反应，主要定位于细胞质，表现为棕黄色或黄色颗粒样物质。Id-1表达阳性率随宫颈癌病变程度的加重而升高，在慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌组织中Id-1阳性表达率分别为0、11.8%、40.0%和74.7%，差异有统计学意义(χ2=45.017，P=0.000)。见表2、图1。表2 Id-1蛋白在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达水平
2.2 Id-1 mRNA在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达 见表3。对36例组织标本进行实时荧光定量RT-PCR检测，得标准曲线回归系数均>0.96，标准曲线拟合满意。Id-1基因扩增效率为1.97，β-actin为1.99。可见，目的基因与管家基因的扩增效率基本相同，故可采用比较阈值法计算Id-1基因拷贝数。CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌组织中Id-1 mRNA的相对表达量分别为慢性宫颈炎组的1.34倍、3.42倍和10.37倍，差异有统计学意义(P=0.003)，Id-1基因表达在宫颈癌组高于癌前病变组(P<0.05)，而在慢性宫颈炎组织中的表达低于宫颈癌(P=0.031)和CINⅡ～Ⅲ组织(P=0.045)。可见，随宫颈癌变程度加重Id-1基因表达增加。图1 宫颈癌及其癌前病变组织中Id-1蛋白的表达情况表3 Id-1 mRNA在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达
3 讨论
3.1 Id-1的结构与功能 Id-1是分化和(或)DNA结合抑制因子(inhibitor of differentiation and/or DNA binding，Id)家族成员之一，Id因子是1990年由Benezra等[3]首先从小鼠红白血病(murine erythro-leukemia，MEL) 细胞 cDNA文库中克隆出来的。Id因子属于HLH转录因子，也是迄今为止发现的惟一具有负性调控HLH基因家族功能的调控蛋白。HLH蛋白是一类具有螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，HLH)结构域的DNA结合蛋白，Id因子可通过HLH结构中的α-螺旋相互作用与其他HLH家族转录因子(主要为bHLH类转录因子)结合形成二聚体，但因其结构内缺乏碱性残基区使得这种二聚体无法有效地结合到DNA上，不能发挥转录因子活性，从而抑制相关基因转录，产生生物学效应。在哺乳动物细胞中已发现4种Id因子，即Id-1～Id-4。目前对Id-1的研究最多，发现其参与细胞分化调控、抑制肿瘤细胞凋亡、诱导细胞永生化、促进肿瘤血管生成等[1，4，5]，在癌症发生发展中起重要作用。而且Id-1在许多上皮来源的肿瘤，如食道鳞状上皮癌[6]、子宫内膜癌[7，8]、肺癌[9]、胃癌等均有高表达，推测Id-1可能参与了这类上皮源性肿瘤的发生。
3.2 Id-1在宫颈癌变过程中的作用 目前，关于Id-1在宫颈癌变过程中表达情况的研究国内外尚无相关报道。仅Schindl等[2]利用免疫组化方法研究发现早期宫颈癌中有Id-1高表达，表达阳性率为79.2%。分别采用免疫组化SP法和实时荧光定量RT-PCR从蛋白和基因水平检测了慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宫颈癌组织中Id-1的表达情况。免疫组化结果显示， Id-1表达阳性率与宫颈癌病变程度密切相关，在慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宫颈鳞癌组织中Id-1蛋白表达阳性率呈逐渐升高趋势(P<0.01)，分别为0、11.8%、40.0%、74.7%，而且Id-1的染色强度也随病变加重而加深，所有的宫颈癌及其癌前病变组织中均出现不同程度的Id-1免疫阳性反应;实时荧光定量RT-PCR检测结果也从基因水平进一步证实了免疫组化的结论，即Id-1mRNA的表达也随宫颈癌变程度加重而增加，CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宫颈鳞癌组织中Id-1 mRNA的相对表达量分别是慢性宫颈炎组织的1.34倍、3.42倍和10.37倍，差异有统计学意义(P<0.05)。综上结果提示Id-1过表达参与了宫颈癌的癌变过程，在宫颈癌的发病机制中可能起到了重要作用，但具体致癌机制有待进一步研究阐明。
流行病学和分子病毒学已有相当多资料证明，人乳头状瘤病毒(HPV)极有可能是宫颈癌的一个主要病因[10]。在持续HPV感染的基础上，由慢性宫颈炎CINⅠCINⅡ～Ⅲ→宫颈浸润癌可能是大多数宫颈鳞癌的发病过程。但HPV感染并不能完全解释宫颈癌的发生，比如，前瞻性研究发现宫颈感染HPV16/18型者在1年内只有1/3发展为CIN，以后也仅约15%将发展为宫颈癌，其余大部分均自行消退。可见宫颈癌的发生机制中，还存在其他HPV协同因素起重要作用。本研究结果初步显示了转录调节因子Id-1与宫颈鳞状上皮癌变进展有关，推测在HPV持续感染的基础上，Id-1可能与HPV E6/E7癌基因协同作用参与了宫颈鳞癌的发病机制，促进了宫颈癌变的持续恶性进展，但尚需更深入的研究证实。
细胞分化受阻引起无限增殖，导致细胞永生化是体外培养细胞恶性转化过程的第一步，也是体内肿瘤发生与发展进程的早期阶段。大量试验结果表明，Id-1具有“永生化”癌基因的某些特性[11]，如抑制细胞分化、引起细胞持续增殖及血管持续新生等。Id-1被认为是致癌性转化的一个重要调节因子。Tang等[12]研究发现，KSHV(卡波济肉瘤相关病毒) 感染人内皮细胞可诱导Id-1表达增加，且内皮细胞增殖加快，提示Id-l表达上调可能是细胞恶性转化的重要步骤。外源性表达Id-1可通过抑制p16INK4a/Rb和p53途径使细胞永生化，促进细胞不断增殖，最终形成肿瘤[4]。有研究显示，同时转染Id-1和抗凋亡因子Bcl-2可诱导成纤维细胞永生化[13]，仅Id-1持续表达就可使皮肤上皮细胞的端粒酶活化，进而导致细胞永生化[4]。此外，Id-1可以通过激活NF-κB途径抑制肿瘤细胞凋亡，通过激活MAPK途径诱导癌细胞增生，促进肿瘤发生。Ling等[15]的研究发现，通过基因转染上调前列腺癌LNCaP细胞Id-1的表达，可增强NF-κB的反式激活及核转移，同时伴有下游效应因子Bcl-xL和ICAM-1的表达上调，使肿瘤细胞凋亡受到抑制;而用反义寡核苷酸技术抑制Id-1表达可抑制NF-κB的激活，使细胞对TNF-α诱导的凋亡敏感。在前列腺癌细胞LNCaP中Id-1 的瞬间表达和稳定表达增加均可活化Raf/MEK1/2信号途径使癌细胞增殖明显加速，而当用MEK1/2抑制剂PD098059阻断Raf/MEK1/2信号途径后，细胞周期S期的有丝分裂受抑制，细胞生长速度减慢，提示MAPK信号途径的活化在Id-1诱导的前列腺癌细胞增殖中起重要作用[16]。
总之，本研究结果表明Id-1在宫颈癌发生发展中起重要作用，靶向抑制Id-1基因表达可能给宫颈癌的治疗带来新的希望。深入研究Id-1在宫颈癌发病机制中的作用对宫颈癌的防治研究有重要意义。
【参考文献】
1 Perk J, Iavarone A, Benezra R. Id family of helix-loop-helix proteins in cancer. Nature Reviews Cancer, 2005,5(8):603-614.
2 Schindl M, Oberhuber G, Obermair A, et al. Overexpression of Id-1 protein is a marker for unfavorable prognosis in early-stage cervical cancer. Cancer Res, 2001, 61(15):5703-5706.
3 Benezra R, Davis RL , Lockshon D, et al. The protein Id: a negative regulator of helix-loop-helix DNA binding proteins. Cell, 1990, 61(1): 49-59.
4 Wong YC, Wang X, Ling MT. Id-1 expression and cell survival. Apoptosis, 2004, 9(3):279-289.
5 Hashmat A, SikDer, Meghann K, et al. Id proteins in cell growth and tumorigenesis. Cancer Cell, 2003, 3(6):525-530.
6 曾达武，方明霞，刘豫瑞. RNA干扰分化抑制因子-1基因表达对食管鳞状细胞癌增殖与凋亡的影响. 福建医科大学学报，2009，6：447-451
7 黄玉秀，郑秀，刘林芳. Id-1在子宫内膜腺癌中的表达及与VEGF、TSP-1的关系. 福建医科大学学报，2009，3： 231-233，240.
8 陈晶晶，陈柯，王晓秋，等. 子宫内膜样腺癌中Id-1、Smad4和p21～(WAF1/CIP1)蛋白及mRNA的表达. 安徽医科大学学报，2010，1：39-43.
9 徐俊，秦治明. Id-1与Id-3在非小细胞肺癌中的表达及临床意义. 重庆医科大学学报, 2010, 2:213-216.
10 连利娟.林巧稚妇科肿瘤学，第4版.北京: 人民卫生出版社, 2006, 278-287.
11 Lasorella A, Uo T, Iavarone A. Id proteins at the cross-road of development and cancer. Oncogene, 2001, 20(58):8326-8333.
12 Tang J, Gordon GM, Muller MG, et al.Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen induces expression of the helix-loop-helix protein ld-1 in human endothelial cells.J Viro1，2003, 77(10): 5975-5984.
13 Norton JD, Atherton GT. Coupling of cell growth control and apoptosis functions of Id proteins. Mol Cell Biol, 1998, 18(4):2371-2381.
14 Alani RM, Hasskarl J, Grace M, et al. Immortalization of primary human keratinocytes by the helix-loop-helix protein, Id-1. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96(17):9637-9641.
15 Ling MT, Wang X, Ouyang XS, et al. Id-1 expression promotes cell survival through activation of NF-kappaB signaling pathway in prostate cancer cells. Oncogene, 2003,22 (29):4498-4508.
16 Ling MT, Wang X, Ouyang XS, et al. Activation of MAPK signaling pathway is essential for Id-1 induced serum independent prostate cancer cell growth. Oncogene, 2002, 21(55): 8498-8505.