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【摘要】 目的 通过检测混合脐带血浆（CBP）对脐血单个核细胞增殖及凋亡的作用，探讨其刺激造血细胞增殖的作用机制。方法 采用5′-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入法检测CBP对脐血单个核细胞DNA合成的影响;Western Blot检测CBP对细胞周期素cyclin A、cyclin D 1 及细胞周期素依赖性激酶CDK2和CDK4表达的影响;姬姆萨染色形态学观察和流式细胞术PI染色法检测CBP对细胞凋亡的作用。结果 （1）加入10%CBP12h后BrdU检测值与对照组（10%FBS）相比无统计学意义;而24h后的检测值与对照组相比P<0.01，显著高于对照组;加入20%CBP后12h和24h的BrdU检测值均显著高于对照组（P<0.05）。（2）20%CBP可明显促进脐血单个核细胞cyclin A、CDK2和CDK4的表达，但对cyclin D 1 的表达影响较小。（3）加入20%CBP继续培养12和24h后，未检测到明显的凋亡，而10%FBS组流式检测凋亡率分别为4.71%和5.76%。结论 20%CBP可通过促进造血细胞DNA的合成和细胞周期蛋白的表达，从而促进细胞增殖并显著抑制造血细胞的凋亡。
关键词 脐带血浆（CBP） 细胞周期 细胞周期素 细胞周期素依赖性激酶 凋亡
Umbilical cord blood plasma effect on proliferation and apoptosis of hematopoietic cells
Zhao Xiangfu，Shi Bin，Cui Jianying，et al.
Department of Hematology，Fu-Xing Hospital，Beijing100038.
【Abstract】 Objective To explore the mechanism for mixture cord blood plasma（CBP）effect on umbilical cord blood mononuclear cells proliferation and apoptosis.Methods 5-bromo-2′-deoxyurine（BrdU）proliferation assay and Western Blo method were adopted to detect cell proliferation，and the Giemsa staining and flow cytometry（FCM）wre used to measure cell apoptosis.Results （1）When added with CBP after12hours，the OD values of10%CBP group showed no significant difference as compared with control group（10%FBS），but the OD values of20%CBP group were significantly
higher than control group.After24hours，the OD values of10%CBP and20%CBP group were both signifiˉcantly higher than ontrol group（P<0.05）.（2）Western Blot results indicated that20%CBP significantly increased the production of CyclinA，CDK2and CDK4，and the protein levels were significantly higher than control group.A little effect was shown on Cyclin D 13）When added with20%CBP for12and24hours，Giemsa staining and FCM didn’t detect typical apoptosis，but the control group showed4.71%and5.76%of apoptosis rate.Conclusion 20%CBP enhanced the expression of G1-Cyclins and CDKs on umbilical cord blood mononuclear cells，that may promote the proliferation of hematopoietic cells.And20%CBPsignificantly inhibited cell apoptosis as well.
Key words cord blood plasma（CBP） cell cycle cyclin cyclin-dependent kinase（CDK） apoptosis
近年来，脐血在基础及临床应用中的研究均取得了重大进展。许多研究表明脐带血浆中含有丰富的造血刺激活性，可以刺激造血细胞的增殖 ［1～4］ ，对造血细胞的体外扩增及临床应用均有重要的意义。我们实验室曾用混合脐带血浆输注来治疗急性白血病化疗后末梢血白细胞减少、重症再生障碍性贫血等，取得了较好的疗效 ［5］ ，因此，脐血是一个值得利 用的宝贵资源。本实验通过观察混合脐带血浆对脐血单个核细胞DNA合成、Cyclins和CDKs表达及凋亡的影响，来探讨脐带血刺激造血细胞增殖的作用机制，为其临床应用提供一定的理论支持。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 足月健康产妇正常分娩断脐后，穿刺脐静脉取血，肝素抗凝，4h内用比重1.007g/L淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞，接种在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基，5%CO 2 、37℃、饱和湿度条件下培养，取对数生长期的细胞用于实验。
1.2 混合脐带
血浆的制备 足月健康产妇正常分娩后，收集脐带血，肝素抗凝，8h内2000rpm/min离心20min，取上清，-20℃冰箱保存。临用前，取出融化，离心祛除冷沉淀，混合5例以上脐带血浆制成混合脐带血浆，56℃30min灭活，0.22μm滤膜过滤后4℃
保存待用。
1.3 BrdU掺入法检测混合脐带血浆对细胞DNA合成的影响
1.3.1 实验试剂 5′-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）细胞增殖检测试剂盒购自德国Oncogene公司。
1.3.2 对照孔设置 每次实验均设2个对照孔;1个空白对照孔（以IMDM培养液代替细胞）和1个BrdU背景对照孔（含细胞，但不加）BrdU标记液），其余步骤不变。
1.3.3 实验步骤 细胞达对数生长期后，无血清培养3天，使大多数细胞处于静止期，然后收集细胞，RPMI1640培养基调细胞浓度为2×10 5 /ml，接种于96孔培养板，100μl/孔。细胞分成三组，分别加入10%FBS、10%CBP和20%CBP，每组设8个复孔。接着加入新鲜培养基1:2000稀释的BrdU标记液的工作液，20μl/孔。分别在继续培养12h、24h后，按试剂盒说明操作，测定每孔样本的BrdU检测值。每份样本检测2次（分别用不同的空白对照孔调零），取平均值。
1.3.4 统计学方法 用SPSS8.0医用统计软件，实验数据以均数±标准差表示，采用两组t检验进行统计学处理，P<0.05表示有
统计学意义。
1.4 Western Blot检测混合脐带血浆对细胞周期蛋白表达的影响 实验试剂Actin兔抗人多克隆抗体，HRP标记羊抗兔及羊抗小鼠IgG（二抗）均购自武汉博士德生物工程公司。CycinA，CyclinD1，CDK2，CDK4小鼠抗人单克隆抗体，购自NeoMarker公司。化学发光底物购自美国Sanata Cruiz公司。 实验步骤，细胞达对数生长期后，无血清培养3天，然后收集细胞重新接种，把细胞分成两组，分别加入10%FBS和20%CBP。分别在继续培养3h、6h、9h……24h，取每组约5×10 6 细胞，用细胞裂解法提取蛋白，进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转膜，5%脱脂奶粉封闭过夜后，依次把硝酸纤维素膜与一抗和二抗孵育，最后加发光液进行暴光、洗片，根据发光强度调整暴光时间和显影时间。
1.5 姬姆萨染色法检测细胞凋亡 取对数生长期细胞，接种于2ml培养皿，分为两组，分别加入:10% FBS和20%CBP，继续培养12h和24h后，收集细胞， 离心甩片，姬姆萨染色法形态学观察细胞凋亡。
1.6 流式细胞术PI染色法检测细胞凋亡 同样取对数生长期细胞，接种于5ml培养皿，分为两组，分别加入:10%FBS和20%CBP，继续培养12h和24h后，离心收集细胞，加入预冷的80%乙醇4℃固定24h，PBS洗2次，加入PI染液工作液（PI:50μg/ml;RNase 0μg/ml;0.5%TritonX-100;0.1%柠檬酸钠），避光染色30min，300目尼龙网过滤后上机检测，每份样品检测50000个细胞，用Cell Quest软件对结果进行分析。凋亡细胞在经过处理及PI染色后，正常二倍体细胞的G0/G1期峰之前出现一亚G1峰，又称AO峰。通过计算机软件分析得出的AO峰的百分率就表示凋亡的发生率。
2 实验结果
2.1 脐带血浆对细胞DNA合成的影响BrdU掺入实验的结果 见表1。
表1 不同浓度的CBP作用12h和24h 后的BrdU测定值 （n=8）（略）
注:12h BrdU测定值与对照（10%FBS）组比较， # P<0.05;24h BrdU测定值与对照组比较， ˇ P<0.05; ˇˇ P<0.01
以上结果表明，加入10%CBP后12h的BrdU检测值与对照组相比差异无显著性（P>0.05）;但24h的BrdU检测值与对照组相比差异有非常显著性（P<0.01），显著高于对照组;而加入20%CBP后12h和24h的检测值均显著高于对照组，表明20%CBP可显著促进造血细胞DNA的合成;而且CBP促进细胞增殖作用在一定范围内呈剂量依赖性，20%CBP刺激强度大于10%CBP。由于本实验分组较少，尚不能得出肯定的结论。
2.2 脐带血浆对细胞周期蛋白表达的影响 以10%FBS为对照，我们检测了20%CBP对cyclinD1、cyclinA、CDK2和CDK4表达的影响。结果表明细胞无血清培养3天，重新加入10%FBS后，cyclinA在9h开始表达，18h达高峰;而20%CBP组cyclinA在6h已有明显的表达，18h达高峰，但表达强度远高于10%FBS组;cyclinD1在3h可检测到少量的表达，但9h才出现明显的表达，10%FBS和20%CBP组之间无明显差别（图1）。加入10%FBS后，CDK2在15h后开始有较高水平的表达，18h达高峰;而20%CBP组CDK2在6h即开始有明显表达，同样18h达高峰，表达强度高于10%FBS组;CDK4在6h开始表达，但20%CBP组的表达强度显著高于10%FBS组。
2.3 脐带血浆对 造血细胞凋亡的影响 细胞达对数生长期后，重新分组，加入10%FBS继续培养12h后，姬姆萨染色形态学观察未发现典型凋亡细胞;24h后，个别细胞出现细胞体积缩小，核着边、胞膜皱缩等凋亡特征性改变，流式检测凋亡率分别为4.71%和5.76%。而20%CBP组继续培养12和24h后姬姆萨染色形态学观察及流式细胞术均无检测到明显的凋亡细胞。
3 讨论
国内外许多学者都对脐带血浆的造血刺激活性进行了研究，但大多着重于研究脐带血浆中是否含有某些可以刺激造血细胞增殖的生长因子。Opˉsiln ［6］ 比较了成人血清与脐带血清中的细胞因子水平，表明脐血清中含有SCF、GM-CSF、G-CSF、IL-6及TNF等多种细胞因子，远高于成人外周血清。我们