不同时期应用氯沙坦治疗糖尿病肾病的比较研究

　　【摘要】  目的  观察在微量白蛋白尿发生前后应用氯沙坦对糖尿病肾病的治疗作用及其机制。方法  单侧肾切除的STZ糖尿病大鼠，随机分为正常对照组（NC）、糖尿病肾病组（DN）、氯沙坦早期治疗组（DL1）和氯沙坦晚期治疗组（DL2）。DL1和DL2组分别于糖尿病模型建立后即刻或第9周起开始给予氯沙坦20mg/（kg·d)灌胃，疗程均为8周。第16周时，观测肾脏形态学及肾功能变化，并采用荧光实时定量RTPCR检测肾脏TGF-β1、CTGF、PAI-1等细胞因子的表达情况。结果  DN对照组大鼠尿微量白蛋白（UAER）持续上升；血肌酐（SCr）、肾脏肥大指数（KW/BW）、肾小球平均体积（MGV）、系膜面积比（FMA）以及肾脏TGF-β1、CTGF、PAI-1和FN的mRNA表达均明显升高，而肌酐清除率（CCr）已开始下降。DL1和DL2组以上指标均明显改善，但两组之间差异无显著性。结论  氯沙坦可通过下调肾脏细胞因子基因表达，起到肾脏保护作用；但在微量白蛋白尿出现之前进行干预并不比在微量白蛋白尿出现之后进行治疗的效果更好。

　　【关键词】  糖尿病肾病；转化生长因子；结缔组织生长因子；纤溶酶原激活物抑制剂-1；氯沙坦

　　Comparative study on effect of losartan applied at different stage on diabetic nephropathy

　　LIU Gang,GUAN Guangju,ZHAO Jingjie,et al.Department of Nephrology,The Second Hospital of Shandong University,Jinan 250033,China

　　【Abstract】  Objective  To estimate the renoproctive effect of angiotensin receptor antagonists on DN by applying losartan before or after microalbuminuria.Methods  40 uninephrectomized male Wistar rats are randomatically divided into 4 groups:normal control (NC),diabetic nephropathy control (DN),Losartan early treatment group (DL1) and Losartan late treatment group (DL2).Rats were made diabetic by single intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ,60mg/kg body weight).DL1 group was treated with Losartan ［20mg/(kg·d),ig］ for 8 weeks immediately after the diabetic mould was made,while DL2 group began their treatment 8 weeks later.At the end of the 16th week,all rats were sacrificed,the left kidney was removed and weighed.Mean glomerular volume (MGV) and fractional mesangial area (FMA) were calculated by medical image analysis system.The mRNA expression of TGFβ1,CTGF,PAI1 and FN were detected by quantitative real time RTPCR.Urinary albumin excretion rate (UAER),as well as serum creatinine (SCr) and creatinine clearance rate (CCr),was detected.Results  Compared with NC group,UAER increased 12.68 folds at the end of the 8thweek and 21.92 folds at the end of the 16thweek in group DN.At the same time,Scr in rats of group DN elevated significantly (136%),KW/BW,MGV and FMA in DN elevated significantly,which were 129%,98% and 183% higher separately,and the mRNA expression of TGFβ1,CTGF,PAI1 and FN in DN group increased 22.92,13.42,28.61 and 5.96 folds separately. All these indices decreased in rats of group DL1 and DL2 (P＜0.05). And there was no significant differences between group DL1 and DL2(P＞0.05). However,Ccr in rats of group DN began to decline already at the end of the 16th week (14.8%,P＜0.05),which in rats of all treated diabetic groups was still higher than that in group NC (P＜0.05).③FMA is negatively correlated with Ccr in rats of group DN at the 16th week.And the mRNA expression level of TGFβ1,CTGF,PAI1 and FN is positively correlated with UAER,KW/BW,MGV and FMA.Conclusion  The mRNA expression level of TGF-β1,CTGF,PAI1 and FN is higher in kidneys of diabetic rats,which was responsible for renal hypertrophy,excess ECM deposition and increased UAER.Losartan could downregulate the mRNA expression of such renal cytokines,therefore prevent the progress of DN.The therapeutic effect is similar no matter we began treatment before or after microalbuminuria,which suggested that microalbuminuria be the appropriate time to begin clinical treatment of DN.

　　【Key words】  diabetic nephropathy;transforming growth factor;connective tissue growth factor;plasminogen activator inhibitor-1;losartan

　　在西方国家，糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）已成为终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）最主要的病因。由此带来的透析、肾移植等治疗费用在整个医疗支出中所占比例正在逐年提高，给病人和社会造成极大的经济负担［1］。近年来ARB类药物的肾脏保护作用日益受到关注。不少学者提出，糖尿病患者即使血压正常也应尽早应用ACEI和ARBs类药物，以达到早期保护肾脏的作用。但此类药物的应用时机究竟应“早”到何时？至今缺乏循证医学证据。本研究将就在微量白蛋白尿出现前后的不同时期应用氯沙坦对DN的治疗作用进行探讨，为临床防治DN的策略选择和时机把握提供实验依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物分组及模型建立  40只清洁级雄性Wistar大鼠,体重180~200g（山东大学实验动物中心提供），随机分为正常对照组(NC)、糖尿病肾病组(DN)、氯沙坦早期治疗组（DL1）和氯沙坦晚期治疗组（DL2）。所有大鼠均经背部切口行右肾切除术。2周后，一次性腹腔内注射链尿佐菌素(STZ，Sigma公司,60mg/kg,溶于pH 4.5、0.1mmol/L枸橼酸缓冲液中)诱导糖尿病模型,NC组仅给予等量缓冲液。72h后，尾静脉采血测随机血糖＞16.7mmol/L，作为糖尿病动物模型建立标准。

　　1.2  实验方法  DL1和DL2组分别于糖尿病模型建立后即刻或第9周起开始治疗，给予氯沙坦（科素亚，杭州默沙东制药有限公司生产）20mg/（kg·d）灌胃，疗程均为8周。正常对照组（NC）和糖尿病肾病对照组（DN）不予治疗。实验期间,每4周测体重、血糖。第8周和16周末,代谢笼收集24h尿,2000r/min离心10min,去沉淀,-20℃保存待测尿肌酐、尿白蛋白排泄率。第16周末，戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔麻醉，腹部正中切口,腹主动脉取血，2000r/min离心10min,取上清，-20℃保存待测血肌酐。取残余肾，剥离被膜，称重后，经肾门纵向剖开,部分以10%中性福尔马林固定，石蜡切片,PAS染色；部分以液氮保存，用于荧光实时定量RTPCR检测。

　　1.3  生化指标检测  尿白蛋白检测采用放免法（试剂盒购自中国原子能科学研究所）。血、尿肌酐用HITACH-7150自动生化分析仪检测,CCr按公式尿肌酐浓度×每分钟尿量(ml)/血肌酐浓度计算,并以体重校正。

　　1.4  肾组织形态学定量分析  每张PAS染色切片在光镜下（×400）随机取30个肾小球，用HPIAS-1000生物医学图像分析系统测定肾小球平均截面积(MGA)、系膜平均面积（MMA），并根据公式［2］：肾小球平均体积(MGV)=1.25·(MGA)3/2计算MGV；根据公式：系膜面积比（FMA）＝MMA/MGA计算FMA。

　　1.5  荧光实时定量RTPCR检测肾脏TGF-β1、CTGF、PAI1和FN mRNA表达  Trizol(上海生工)提取肾皮质总RNA。电泳鉴定RNA完整性。取总RNA 2μg逆转录合成cDNA。逆转录反应体系包括随机引物2μl、5×Reaction Buffer 4μl、10mM dNTP 2μl、ribonuclease inhibitor 1μl、MMLV逆转录酶1μl，总体积20μl。采用ABI PRISM 7000 SDS进行realtime PCR。TGFβ1、CTGF、PAI-1、FN与GAPDH引物由上海生工合成(见表1)。PCR反应体系:5×SYBR Green PCR Buffer 2μl,dNTP 0.5μl,MgCl28μl,AmpliTaq Glod 0.25μl,目的基因上、下游引物各2μl,逆转录产物2μl,总体积25μl。PCR参数：预变性94℃2min；94℃15s、55℃30s、72℃45s，共50个循环。结果以目的基因与内参照GADPH的比值表示，以平衡样本中细胞含量的差异。

　　表1  PCR引物序列（略）

　　1.6  统计学方法  所有数据均以均数±标准差（x±s）表示,组间比较采用方差分析和q检验，指标之间的相互关系采用Pearson直线相关回归分析（SPSS 10.0统计分析软件），以P＜0.05为差异有显著性标准。

　　2  结果

　　2.1  一般情况  实验期间，3只未成模大鼠被剔除；另外，DN组有3只大鼠因高血糖、感染等原因死亡；NC、DL1和DL2组各有2只大鼠死亡，均未记入最后统计。

　　2.2  体重与血糖  各组糖尿病大鼠的体重均较正常大鼠明显减轻（P＜0.01），而各糖尿病组之间差异无显著性（P＞0.05）见表2。血糖变化情况与体重变化情况相似，各组糖尿病大鼠的血糖均较正常大鼠明显升高（P＜0.05），而各糖尿病组之间差异并无显著性（P＞0.05），见表3。说明氯沙坦对大鼠的体重和血糖水平均不产生影响。

　　表2－表3  （略）

　　2.3  尿微量白蛋白排泄率（UAER）、肌酐清除率（CCr）  与NC组相比,DN组大鼠UAER于第8周时即显著升高（12.68倍）；第16周时，UAER仍持续上升（21.92倍），比第8周时升高95％。各治疗组与DN组相比，UAER均有不同程度的下降（P＜0.05），但仍高于NC组（P＜0.05）。DL1和DL2组之间差异无显著性（P＞0.05），见表4。

　　表4  各组大鼠肾功能变化的比较  （略）

　　DN组大鼠的SCr比NC组明显增高（136％，P＜0.05）；各治疗组与DN组相比，SCr均有显著下降（P＜0.05），且与NC组大鼠的SCr水平相当（P＞0.05）。同时，DN组大鼠的CCr与NC组相比，已开始下降（14.8％，P＜0.05）；各治疗组大鼠的CCr却仍高于NC组（P＜0.05）。DL1和DL2组之间差异无显著性（P＞0.05），见表4。

　　2.4  肾脏组织形态学改变

　　2.4.1  光镜表现  PAS染色切片高倍镜（×400）下显示，第16周时，DN组大鼠肾小球体积增大，肾小球基膜增厚，肾小球系膜扩张，红染区明显扩大，肾小球毛细血管腔受压变窄。各治疗组大鼠的上述病变均有不同程度的减轻（见图1~4）。
2.4.2  肾脏肥大指数(KW/BW)、肾小球平均体积(MGV)、系膜面积比（FMA）等定量指标  与NC组相比,DN组大鼠KW/BW、MGV、FMA均明显增大（分别为86％、64％、183％）。各治疗组与DN组相比，KW/BW、MGV、FMA均有不同程度的下降（P＜0.05），但仍高于NC组（P＜0.05）。其中DL1和DL2组之间差异无显著性（P＞0.05），见表5。

　　表5  第16周时各组大鼠肾脏组织形态学变化的比较  （略）

　　2.5  肾脏TGF-β1、CTGF、PAI-1、FN等基因表达情况  与NC组相比，各组糖尿病大鼠肾脏TGF-β1、CTGF、PAI-1和FN的mRNA表达均明显升高（P＜0.05）。DN组大鼠肾脏TGF-β1、CTGF、PAI-1和FN的mRNA表达升高幅度分别达2292％、1342％、2861％、596％。与DN组相比，各治疗组大鼠肾脏TGF-β1 mRNA表达均有不同程度下调（P＜0.05)。其中DL1和DL2组之间差异无显著性(P＞0.05)见表6。说明，无论早期治疗或晚期治疗，氯沙坦均可明显抑制糖尿病大鼠肾脏TGF-β1、CTGF、PAI-1和FN的基因表达，且效果相当。

　　表6  第16周时各组大鼠肾脏TGF-β1、CTGF、PAI-1、FN等mRNA表达比较  （略）

　　3  讨论

　　3.1  细胞因子在DN发病机制中的作用  本研究显示，第16周时，糖尿病大鼠出现肾脏肥大、肾小球体积增加、基膜增厚、系膜细胞增生和系膜基质扩张等病理改变，同时伴有尿白蛋白排泄率增加、肌酐升高和肾小球滤过率下降，符合临床DN的特征,与Volpini等的研究结果相似［3,4］。

　　DN的早期病理特征是肾小球肥大、基膜增厚和系膜基质扩张，晚期则表现为肾小球硬化和间质纤维化。细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)进行性积聚是其共同的病理基础。研究表明，在DN亚临床期即可出现系膜扩张，而且其进展与肾脏病变的进展密切相关。本研究结果显示，第16周时，DN组大鼠的FMA比NC组大鼠增加183％，系膜基质面积占肾小球面积的51％；同时CCr下降14.8％。提示由于系膜扩张、系膜与肾小球其他部分的体积比增加，毛细血管腔受压变窄甚至闭塞，滤过面积减少，是导致肾功能进行性减退的主要原因［5］。

　　合成与降解失衡是造成ECM积聚的主要原因，细胞因子在这一过程中起关键作用［6］。动物研究发现，肾脏TGF-β1在糖尿病肾病的早期和晚期均升高［7］。db/db糖尿病小鼠即使在DN早期，仅有轻度系膜增生而无蛋白尿和间质病变时，其肾小球中的CTGF mRNA增高已达27倍［8］。2002年，Paueksakon等［9］首次证实在DN患者肾组织局部存在PAI-1蛋白表达增多。随后的动物实验研究［10］也证实,STZ诱导大鼠糖尿病后4周、12周和24周时，其肾小球PAI-1 mRNA表达持续增高。我们利用RTPCR检测发现，糖尿病大鼠肾脏TGF、CTGF、PAI-1等细胞因子和ECM成分FN的mRNA表达水平显著升高，与国内外研究结果一致［11］。

　　TGF-β被认为是肾小球硬化和肾小管间质纤维化发病机制中最关键的细胞因子，在DN相关的生长因子网络中处于中心地位。结缔组织生长因子（conective tissue growth factor，CTGF）则被认为是介导TGF-β促纤维化活性的下游效应因子，在刺激细胞增生和细胞外基质（ECM）合成、促进组织器官纤维化方面起重要作用。而纤溶酶原激活物抑制剂（plasminogen activator inhibitor，PAI）在ECM降解酶系统中占据重要地位。糖尿病时，高血糖及其代谢紊乱、血流动力学改变等均可刺激肾脏局部TGFβ、CTGF、PAI-1等细胞因子表达上调，导致ECM合成增多、降解减少，促使ECM在肾脏过度蓄积，促成肾小球硬化、间质纤维化的发生。阻断这些细胞因子的表达与合成，或阻断其受体及受体后效应，将为临床防治DN提供一条安全有效的新途径。

　　3.2  氯沙坦在DN防治中的作用  RAS激活、AngⅡ增加是DN发病机制中的关键环节。所以,抑制AngⅡ的产生并干扰其作用过程是DN治疗的关键。一些大型临床研究如RENAAL、IRMA及IDNT等验证了ARB在保护DN方面的有益作用。可明显降低糖尿病患者的尿白蛋白排泄率、血肌酐、ESRD和死亡发生率等指标,且这种保护作用独立于其降血压作用之外。
大量动物实验研究［12,13］也证实，在糖尿病模型建立成功之后立即应用氯沙坦治疗，可明显降低糖尿病大鼠的尿白蛋白排泄率、减轻肾小球肥大，对早期DN具有良好的防治作用。本研究发现，氯沙坦可显著降低DN大鼠肾脏TGF-β、CTGF、PAI-1及FN mRNA表达，并能显著减少DN大鼠的24h尿蛋白排泄量、改善肾小球体积增大、系膜基质扩张及其相关的组织病理学异常。但有趣的是，在微量白蛋白尿出现之前或之后应用氯沙坦，对DN的防治作用并没有明显差异（P＞0.05）。提示氯沙坦确实可通过抑制糖尿病大鼠肾脏细胞因子的表达而起到一定的肾脏保护作用；但在相同剂量、相同疗程的情况下，在微量白蛋白尿出现之前进行干预并不比在微量白蛋白尿出现之后进行治疗的效果更好。我们应该积极探求其他更有效的DN一级预防措施。
（本文图片见封三）

　　【参考文献】

　　1  Hogan P, Dall T, Nikolov P. American diabetes association. Economic costs of diabetes in the US in 2002. Diabetes Care,2003,26(3):917-932.

　　2  Ota T, Takamura T, Ando H, et al. Preventive effect of cerivastatin on diabetic nephropathy through suppression of glomerular macrophage recruitment in a rat model. Diabetologia,2003,46(6):843-851.

　　3  Volpini RA, Da Silva CG, Costa RS, et al. Effect of enalapril and losartan on the events that precede diabetic nephropathy in rats. Diabetes Metab Res Rev,2003,19(1):43-51.

　　4  黎锋，丁鹤林，徐明彤，等.氯沙坦对糖尿病大鼠肾组织一氧化氮水平的影响.中华肾脏病杂志，2002，18（2）：115-119.

　　5  Osterby R, Parving HH, Nyberg G, et al. A strong correlation between filtration rate and filtration surface in diabetic nephropathy. Diabetologia,1988,31(5):265-270.

　　6  Eikmans M, Baelde JJ,De Heer E, et al. ECM homeostasis in renal diseases: a genomic approach. J Pathol,2003,200(4):526-536.

　　7  Ziyadeh FN, Han DC. Involvement of transforming growth factorbeta and its receptors in the pathogenesis of diabetic nephrology. Kidney Int Suppl,1997,60:S7-11.

　　8  Riser BL, Cortes P. Connective tissue growth factor and its regulation: a new element in diabetic glomerulosclerosis. Ren Fail,2001,23(3-4):459-470.

　　9  Paueksakon P, Revelo MP, Ma LJ, et al. Microangiopathic injury and augmented PAI1 in human diabetic nephropathy. Kidney Int,2002,61(6):2142-2148.

　　10   Kenichi M, Masanobu M, Takehiko K, et al. Renal synthesis of urokinase type-plasminogen activator, its receptor, and plasminogen activator inhibitor-1 in diabetic nephropathy in rats: modulation by angiotensin-convertingenzyme inhibitor. J Lab Clin Med,2004,144(2):69-77.

　　11  程虹，田雪飞，董鸿瑞，等.波生坦及依那普利对糖尿病肾病模型干预的对比研究.中华肾脏病杂志，2004，20（3）：154-158.

　　12  郭志新，邱明才.氯沙坦对大鼠糖尿病模型肾脏转化生长因子βⅠ型、Ⅱ型受体表达的影响.中华内科杂志，2003，42（6）：403-407.

　　13  卢筱华，冯列，许敏华.氯沙坦对糖尿病大鼠肾脏保护作用的探讨.中华肾脏病杂志，2000，16（3）：182-185.

　　*基金项目：国家教育部博士点基金资助项目（编号：20030422068）

　　山东省中医药管理局资助项目（编号：200329105）

　　作者单位： 250033 山东济南，山东大学第二医院肾内科（*分子生物学实验室，△通讯作者）

　　 (编辑：商  洁)