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【摘要】 目的 了解大肠癌细胞株（SW480，LOVO，HT29）线粒体DNA的突变，克隆突变的大肠癌线粒体DNA（mtDNA）基因，构建pcDNA3.1（+）-mtDNA真核表达重组体，并导入NIH3T3及LST细胞，以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法 提取大肠癌细胞株（SW480，LOVO，HT29）mtDNA,扩增D-LOOP区，产物用DNA自动测序法进行序列分析。利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+),并用脂质体法导入NIH3T3及LST细胞。用MitoCapture Mitochondrial Apoptosis Detection Kit试剂盒染色后用流式细胞仪及荧光显微镜检测转染细胞的凋亡情况。扩增并测序分析转染细胞的D-LOOP区突变特点。结果 检测出大肠癌细胞株SW480，LOVO，HT29细胞mtDNA D-LOOP分别有10，9，8个突变位点。转染前后，各组间细胞凋亡无明显变化。转染细胞的核基因组可扩增出目的基因及Neo基因。4株NIH3T3转染细胞mtDNA D-环区分别检测到9，11，8，4个突变点，并相应有3，4，3，2个多态性变化。结论 （1）转染突变的大肠癌细胞mtDNA后转染细胞的mtDNA均可发生多处的突变位点。（2）通过转染后突变的外源性的mtDNA可以整合到核基因组内。（3）突变的mtDNA转染LST细胞及NIH3T3细胞后，不影响转染细胞的凋亡改变。（4）mtDNA的突变可能通过影响体细胞mtDNA的突变和通过外源性mtDNA在核内的整合从而影响癌基因或抑癌基因的表达异常，从而参与肿瘤的发生发展。
【关键词】 线粒体DNA；D—环区；突变；质粒；pcDNA3.1(+);转染
The research of transfecting mutated mtDNA of colorectal carcinoma cell line into NIH3T3 cell line and LST cell line
SONG Wei-bing,XIAO Bing,ZHANG Zhen-shu,et al.Institute for Digestive Disease of Nanfang Hospital,
The Nanfang Medical University,Guangzhou 510515,China
【Abstract】 Objective To investigate mutations in the D-LOOP region of mitochondrial DNA in colorectal carcinoma cell lines,construct eukaryotic cell expression recombinant pcDNA3.1(+)-mtDNA and transfect pcDNA3.1(+)-mtDNA in murine fibroblast cells.Methods The D-LOOP region of the three colorectal carcinoma cell line (SW480,LOVO,HT29) were amplified by PCR and sequenced.The fragment of mtDNA were recombined in the eukaryotic cell expression plasmid pcDNA3.1(+),the pcDNA3.1(+)-mtDNA recombinant were used to infect marine fibroblast cell NIH3T3.Results Among the three colorectal carcinoma cell line (SW480,LOVO,HT29),there were respectively 10,9,8 mutations were identified.There's no obvious differences in apoptosis between groups after transfection.Target gene and neo gene can be amplified in nuclear genome of transfected cells.There were respectively 9,11,8,4 mutations identified in the four transfected NIH3T3 cell lines.And there were respectively 3,4,3,2 polymorphism mutation points.Conclusion 1,After transfected the mutated mtDNA of colorectal carcinoma,the mtDNA D-loop region of the transfected cells displays new mutation points.2,The external source pieces of the mutated mtDNA can integrate to nuclear genome after transfection.3,There's no differences in apoptosis between combinations after transfected the mutation of mtDNA in NIH3T3 and LST cells.4,The mutated mtDNA may affect the action mechanism of occurrence and development in colorectal carcinoma through affecting its mtDNA mutation or integrating exogenetic mtDNA to its nuclear which may cause the abnormal expression of oncogene or anti-oncogene.
【Key words】 mitochondria DNA;D-loop;mutation;plasmid;pcDNA3.1(+);transfect
大肠癌是一种涉及许多相关基因的多因素、多阶段的恶性肿瘤。实验表明染色体外存在抑癌因素［1，2］，维持细胞的肿瘤特性需要线粒体DNA的参与［1，3］。本课题组通过PCR及测序等技术分析了人大肠癌细胞株中细胞线粒体DNA变异，包括突变、缺失、DNA不稳定性等，发现通过SW480，LOVO，HT29细胞株的mtDNA D-环区基因序列测序，检测出分别有10、9、8位突变点。而且检测到不同癌细胞株中检测到相同的突变位点。为了进一步研究mtDNA突变与肿瘤发生发展的内在联系，我们将大肠癌细胞突变的mtDNA转染小鼠成纤维细胞（NIH3T3）及人大肠侧向发育性肿瘤细胞（LST），观察转染细胞的凋亡、线粒体DNA改变的特点和mtDNA片段在转染细胞核内的整合情况。旨在初步探讨线粒体突变和肿瘤的关系。
1 资料与方法
1.1 主要试剂 线粒体提取试剂盒购于杭州唯特洁公司，TaKaRaLA Taq，T4连接酶，限制性内切酶（BamH I,Xho I）购于大连宝生生物工程公司；DNA marker为天为时代公司产品；凝胶回收试剂盒和超纯质粒中量提取试剂盒购自QIAGEN公司。大肠杆菌JM 109本室保存。pMD18-T载体，真核表达质粒pcDNA3.1(+)为本室留美博士后陈学清博士后惠赠。Lipofectamine2000为Invitrogen公司出产。高糖DMEM，胎牛血清购于haikelong公司，NIH3T3购于本校病理生理教研室。G418购自OMEGA公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 人大肠癌细胞株SW480，LOVO，HT29均为本室购所冻存。用含体积分数为15%胎牛血清、青霉素和链霉素各100μg/ml的RPMI1640，37℃，体积分数5% CO：环境常规传代培养，待细胞生长至对数生长期即可抽提其mt DNA。
1.2.2 mtDNA D—环区的PCR扩增 引物由上海博亚公司合成，上游引物5'-ATCGGATCCTTCATGGGGAAGCAGATTTGG-3'下游引物：5'-ACGCTCGAGGGAGGTAAGCTACATAAACTG-3'。PCR的反应体积是25μl，包括各1μl的两种引物（20pmol/μl），1μl的10 xBuffer,12.5μl PFU,各1μl的癌细胞mtDNA及作为对照的正常人血白细胞mtDNA，用PCR仪（GeneAmp9600,美国Perkin Elmer）进行反应：起始变性温度94℃，2min，以下过程进行33个循环：变性温度94℃，30s；复性温度56℃，30s；延伸温度72℃，30s，结束延伸温度72℃，2min。
1.2.3 产物的证实、纯化和测定 取2μl的反应产物，在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，确定D—环区成功扩增后，用快速PCR纯化药盒（OMEGA，美国）对反应产物进行纯化。送上海博亚公司测序。将肿瘤组织线粒体DNA D—环区序列与正常组织的进行对比，并与基因库数据（http://www.Infinity.gen.emory.edu/mitomap.html)对照。当线粒体DNA D—环区的核苷酸顺序与正常顺序不同时，这种改变为突变；为除外系统误差，用重新合成引物：Primer1 A (bp68):5'-atcATCGGATCCTTCATGGGGAAGCAGATTTGG-3',Primer1 B (bp1205C）：5'-acgACGCTCGAGGGAGGTAAGCTACATAAA CTG-3'重新扩增线粒体D—环区，再次测序，证实了突变确实存在。
1.2.4 PCR产物的纯化与回收 按QIAGENE公司试剂盒操作说明，用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收和纯化PCR产物。
1.2.5 PCR产物（目的基因）与pMD18-T载体连接 10μl反应体系含pMD 18-T载体1μl，目的基因4μl，Buffer（含连接酶）5μl，16℃连接过夜。
1.2.6 连接产物转化大肠杆菌 CaCI法制备感受态大肠杆菌JM 109。将10μl连接产物加入100μl感受态菌中，冰溶30min，42℃热休克90s，立即静置冰浴2min，加入400μl LB培养基，37℃温和振摇1h，短暂离心，弃一部分上清，余约200μl与菌体混匀，全部用无菌铺菌棒均匀涂布于含50mg/L氨苄青霉素的LB选择平板上，室温平放30min后，置37℃温箱倒置培养14~16h。
1.2.7 阳性克隆的筛选与测序 从LB选择平板上挑取单克隆于含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃剧烈振摇过夜，按试剂盒操作说明，少量抽提质粒，用Xho I和BamH I双酶切和PCR法检测，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性质粒。阳性质粒送北京奥科公司测序。
1.2.8 目的基因定向亚克隆构建 pcDNA3.1(+) mtDNA真核表达质粒pMD18-T和pcDNA3.1（+）质粒均用Xho I和BamH I双酶切后低熔点琼脂糖凝胶回收目的基因线粒体DNA D—环区和pcDNA3.1（+）酶切片段，T4连接酶连接，转化JM 109菌株，筛选阳性克隆，双酶切和PCR鉴定。阳性质粒送北京奥科公司测序。
1.2.9 NIH3T3细胞转染及筛选 将阳性质粒SW480—pcDNA3（+），LOVO—pcDNA3.1（+），HT29—pcDNA3.1（+），及作为对照的正常人血白细胞—pcDNA3（+），空质粒pcDNA3（+）用QIAGEN公司的中量超纯质粒提取试剂盒提取，用脂质体法（lipofectamine 2000)，按脂质体试剂盒说明方法转染NIH3T3及LST细胞，并分别用G418 200μg/ml，400μg/ml筛选获得稳定的阳性克隆，扩增培养。
1.2.10 转染后细胞凋亡情况的检测 用BioVision公司的MitoCapture Mitochondrial Apoptosis Detection Kit试剂盒染色后用流式细胞仪及荧光显微镜检测。
1.2.11 mtDNA整合到NIH3T3，LST细胞核基因组内的鉴定 用申能博彩生物科技有限公司的核基因组提取试剂盒分别提取转染后阳性克隆细胞的核基因组，根据NeO基因序列设计引物，用PCR的方法扩增出NeO变化情况的检测 提取转染pcDNA3.1(+)-SW480 mtDNA，pcDNA3.1(+)-LOVO,pcDNA3.1(+)-NHWBC mtDNA重组质粒及空pcDNA3.1（+）后48h的LST细胞、NIH3T3细胞及经G418抗性筛选得到的稳定克隆的NIH3T3细胞mtDNA。用各自引基因及NIH3T3和LST细胞mtDNA D-LOOP区。
1.2.12 转染细胞线粒体PCR扩增 mtDNA D—环区，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR成功扩增后，送上海博亚生物工程公司测序。
2 结果
2.1 三株大肠癌细胞株的线粒体提取 用唯特洁公司线粒体提取试剂盒抽提的线粒体DNA质量良好，用琼脂糖凝胶电泳检测未降解。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳可见一条清晰的特异性扩增条带，其大小与理论预期值相符，为1119bp大小片断。
2.2 测序结果 SW480，LOVO，HT29细胞株的mtDNA D—环区基因序列，检测出分别有10、9、8位突变点。将肿瘤组织线粒体DNA D—环区序列与正常组织的进行对比，并与基因库数据（http://www.Infinity.gen.emory.edu/mitomap.html）对照。当肿瘤组织线粒体DNA D—环区的核苷酸顺序与正常组织的相同、但与基因库记载的不同时，这种改变为新的多态性变化，如LOVO细胞的72位，C—T，SW480细胞16298位，C—T，HT细胞73位A-G。当肿瘤组织线粒体DNA D—环区的核苷酸顺序与正常组织的不同时，这种改变为突变，本研究检测到不同癌细胞株中检测到相同的突变位点，如LOVO细胞与SW480细胞均有16224位，T—G，16311位，T—C。SW480细胞与HT29细胞均有114位，C—T，498位，C—T，16234位，C—T。
2.3 真核表达质粒pcDNA3.1（+）-mtDNA的鉴定 10g/L琼脂糖凝胶电泳检测可见pcDNA3.1（+）-mtDNA D比空pcDNA3.1（+）质粒滞后，两者经Xho I和BamH I双切酶分析可见，pcDNA3.1(+)-mtDNA D经双酶切后得到两条清晰条带，一条为5.0kb的空pcDNA3.1（+）载体条带，一为目的mtDNA D条带，而pcDNA3.1(+）空质粒只有一条5.0kb的条带，pcDNA3.1（+）-mtDNA D重组质粒PCR结果，得到一清晰的1119bp目的基因条带，而空pcDNA3.1(+)质粒PCR结果无条带出现（见图1）。DNA测序结果表明，pcDNA3.1（+）-mtDNA D质粒中的插入片段序列与测过的突变的人大肠癌基因组的基因序列完全一致。
lane1:双酶切的p.CDNA3.1(+)lane3,5,6：双酶切的SW480.LOVO；人血白细胞mtDNAlane2,4,7：单酶切的SW480.LOVO；人血白细胞mtDNA图1 真核表达质粒pcDNA3.1(+)-mtDNA重组质粒双酶切及单酶切结果
2.4 NIH3T3细胞转染及筛选 将阳性质粒用脂质体法（lipofectamine 2000），转染NIH3T3及LST细胞，并分别用经G418 200μg/ml，400μg/ml筛选获得稳定的阳性克隆。
2.5 4株转染细胞的凋亡检测结果 将瞬时表达及稳定克隆NIH3T3及LST细胞株扩增并进行凋亡检测，各组间细胞凋亡无明显变化。
2.6 mtDNA在转染细胞基因组内的整合的鉴定 提取转染细胞的核基因组，用相应的引物分别扩增得到Neo基因及转染的目的片断。
2.7 4株转染细胞mtDNA D—环区测序变异结果 转染pcDNA3.1（+）-SW480 mtDNA，pcDNA3.1（+）-LOVO，pcDNA3.1(+)-normal human white blood cell mtDNA重组质粒及空pcDNA3.1(+)的NIH3T3细胞的mtDNA D-LOOP区的序列分别和未转染的NIH3T3细胞及基因库数据（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.）对比，分别检测到9、11、8、4个突变点，其中分别有3、4、3、2个多态性变化。
3 讨论
人类体细胞中除了红细胞，其他所有细胞均含有线粒体。线粒体被誉为细胞的动力室。mtDNA的基因结构显示了极度的经济性，除D-环区外，相邻的基因之间几乎无任何非编码碱基，且部分基因重叠。由于mtDNA在整个细胞周期中不间断复制，因此任何mtDNA基因序列的改变都将对线粒体功能产生巨大影响［4~7］。mtDNA突变可导致肿瘤，已为人们所公认，但机制尚不完全清楚。近年来，人们把目光逐渐转向mtDNA与nDNA的相互作用方面，试图找到其中的联系。
本研究中，我们将重组质粒pcDNA3.1（+）-SW480 mtDNA，pcDNA3.1(+)-LOVO，pcDNA3.1(+)-NHWBC mtDNA及空pcDNA3.1(+)转染到NIH3T3及LST细胞，经G418抗性筛选，得到稳定克隆后提取转染后的NIH3T3细胞核基因组，用相应的引物扩增得到Neo基因和转染的目的片断。证明外源的mtDNA已成功整合到核基因组中。再提取转染后的NIH3T3细胞mtDNA，扩增mtDNA D—环区，将测序结果的序列分别和未转染的NIH3T3细胞及基因库数据（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.）比对，分别检测到9、11、8、4个突变点，其中分别有3、4、3、2个多态性变化。且pcDNA3.1(+)-SW480mtDNA，pcDNA3.1（+）-LOVO，pcDNA3.1(+）-NHWBC mtDNA重组质粒后的NIH3T3细胞线粒体突变数较转染空pcDNA3.1(+)的多，可见突变的mtDNA可以通过转染引起转染细胞的mtDNA发生相应的突变，这种突变可能会引起肿瘤的发生发展，也可能使突变的mtDNA整合到核基因组癌基因或抑制基因上，使癌基因激活或抑癌基因失活，从而诱导细胞发生癌变。
本研究观察了转染后48h的LST细胞及NIH3T3细胞，经G418抗性筛选得到稳定克隆的NIH3T3细胞的凋亡情况，发现转染前后，各组间细胞凋亡无明显变化。考虑原因有：（1）线粒体mtDNA的突变尚未能够触发引起线粒体起始的细胞凋亡的传导系统。（2）转染细胞群体的状态不是很好，细胞较大，离心时受机械性作用而损伤，所以出现非特异性染色细胞碎片群，图中表现为细胞碎片群为呈斜向右上角的方向拖尾状分布。（3）在使用流式细胞仪检测该转染细胞时，未能有效地对荧光补偿进行调试。
肿瘤是多因素、多步骤发展的产物，各种致癌物既然能有效地作用于mtDNA引起其产生与肿瘤相关的遗传改变，那么mtDNA在肿瘤细胞中的生物学意义必将得到重视。通过本实验，初步得出以下结论：（1）突变的外源性的mtDNA通过转染后是可以整合到核基因组内。（2）突变的mtDNA转染LST细胞及NIH3T3细胞后，不影响对细胞凋亡。（3）mtDNA的突变可能通过影响体细胞mtDNA的突变和通过外源性mtDNA在核内的整合从而影响癌基因或抑癌基因的表达异常，从而参与肿瘤的发生发展。但其间的相互影响的机制尚不完全清楚。因此，深入研究肿瘤细胞mtDNA的结构及表达调控变化，探讨mtDNA突变与肿瘤的关系，对阐明细胞的癌变机制具有重要意义。
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*基金项目：广东省自然科学基金（编号：037049）
作者单位： 510515 广东广州，南方医科大学南方医院消化病研究所
(编辑：江 宇)