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【摘要】 目的采用99Tcm-HL-91作为乏氧显像剂，应用18F- FDG 符合显像，探讨肿瘤放射治疗前、治疗中以及治疗后的乏氧状态与放疗疗效之间的关系，以期为临床应用99Tcm-HL-91提供实验依据，帮助临床评价疗效，指导治疗方案。方法(1)选取25 只昆明种小鼠，体质量(27±3)g,采用完全随机方法分为两组(对照组和实验组)，每组10只，5只用于制备腹水模型鼠;(2)S180腹水瘤细胞株，复苏后分别接种于5只小鼠腹腔，待腹水形成后，抽取1ml稀释至活瘤细胞计数大于2 ×106个/ml 瘤细胞悬液，于每只小鼠右后肢皮下接种0.2ml。待瘤体长至1～1.5cm 时用于实验。(3)99Tcm-HL-91显像：99Tcm-HL-91由广东希埃核医药中心提供，通过小鼠尾静脉注射99Tcm-HL-91 37 MBq 4h后，分别于放疗前、放疗后1h、2天和10天进行显像。仪器采用美国GE Hawkeye VG SPECT仪，配以低能通用准直器，矩阵128×128，采集时间150s，放大倍数1.3。(4)18F-FDG显像：18F-FDG由广东希埃核医药中心提供，分别于放疗前和放疗后11天进行显像。显像前12h禁食，小鼠尾静脉注射18F-FDG 11.5 MBq ，30min后腹腔注射0.1%戊巴比妥钠麻醉，采用美国GE Hawkeye VG SPECT仪，配以高能符合线路准直器，矩阵128×128，采集时间150s，放大倍数1.3。(5)放射治疗：第1次99Tcm-HL-91和18F-FDG显像结束后，两组小鼠分别给予0Gy和8Gy的X线加速器照射。(6)图像处理和半定量分析：于图像上肿瘤部位和小鼠肺野设等大感兴趣区(ROI)，获得显像肿瘤/非瘤(T/NT)摄取比值(UR)。(7)同时，依据小鼠模型的显像结果，对临床肺肿瘤患者99Tcm-HL-91显像的可行性进行了初步研究。结果放疗前和放疗后1h、2天、10天 99Tcm-HL-91的UR值分别为(3.53±1.62)、(3.41±1.42)、(2.55±1.57)和(1.26±0.03)，表明放疗后肿瘤出现再氧合，乏氧状态依次减低。对照组各时相的UR值分别为(3.62±1.65)、(3.02±1.94)、(4.10±1.48)和(2.96±2.02)，UR值无明显递减趋势，表明肿瘤乏氧状态未见减低，甚至在2天时段出现加重。放疗前和放疗后11天18F-FDG显像的UR比值分别为(2.49±1.29)和(1.49±0.56), UR值亦呈现依次递减趋势，与99Tcm-HL-91显像一致。表明放疗后肿瘤葡萄糖代谢活性减低。对照组的UR值分别为(2.22±0.45)和(1.89±0.08)，UR值也出现减低，但变化不明显，而且大部分小鼠在显像前死亡。3例肺肿瘤患者99Tcm-HL-91显像均得到良好显示，UR值分别为：1.72、2.63和1.93。结论放疗前后99Tcm-HL-91显像的UR比值能够较好地评价肿瘤乏氧水平，并可初步评价疗效，为在活体评价放疗后肿瘤再氧合过程提供了一种新方法。
【关键词】 氟脱氧葡萄糖F18; 99Tcm-HL-91;放射性核素显像;乏氧;肿瘤
ObjectiveTo investigate the relationship between radiotherapy effect and 99Tcm-HL-91 and 18F-FDG imaging in S180 mouse, we investigate the relationship between radiotherapy efficacy before and after radiation treatmen and the tumor hypoxic level with the 99Tcm-HL-91 hypoxic imaging agents and the application of the 18F-FDG tumor metabolic imaging method. We hope these findings can provide the useful evidence for 99Tcm-HL-91 clinical application for evaluating tumor hypoxic state in vivo and helping the treatment strategy choices.Methods(1)Twenty male Kunming mice(27±3) g, were randomly divided into two groups of radiotherapy and non-radiotherapy control group. (2)S180 cell lines were thawed injected into peritoneal cavity of the other 5 mouse. When the S180 tumor liquid developed, 1ml liquid were dripped and dilute to the suspension solution of 2×106 cells. Then, 0.2ml of it was injected into the hippo of right rear leg of mouse. The mouse model was used to experiment while the tumor dimension developed to 1-1.5 cm. (3)99Tcm-HL-91 imaging: 37 MBq 99Tcm-HL-91, obtained from Guangdong xiai radio-pharmaceutical center, was injected into mouse models by tail vein. After for 4h, SPECT imaging were taken before and after radiotherapy at the time of 1h,2d and 10d. GE Hawkeye VG SPECT，equipped with low energy collimator,matrix 128×128, zoom 1.3, was used to acquisite images for 150 seconds. (4)18F-FDG imaging: 11.5 MBq 18F-FDG, obtained from Guangdong xiai radio-pharmaceutical center, was injected into mouse models by tail vein. After for 30 min,SPECT imaging were taken before and after radiotherapy at the time of 11d. GE Hawkeye VG SPECT，equipped with high energy coincidence collimator,matrix 128×128, zoom 1.3, was used to acquisite images for 150 seconds. (5)Radiotherapy: Two groups mouse was irradiated to 0Gy and 8Gy X-ray after the first 99Tcm-HL-91and 18F-FDG imaging.(6)Images analysis: the ROI region, in tumor and lung site, was drawed for calculate the UR(uptake ratio).(7)Meanwhile, the possibility of the clinical application of 99Tcm-HL-91 was also investigated on the 3 patients with lung cancer.ResultsAfter 1 h,2 d and 10d of radiation exposure,the UR values in 99Tcm-HL-91 imaging were(3.53±1.62),(3.41±1.42),(2.55±1.57)and(1.26±0.03)，respectively, while the UR values were(3.62±1.65),(3.02±1.94),(4.10±1.48)and(2.96±2.02)in control group. This revealed that tumors hypoxic level was decreased after radiation and suggested that tumors develop re-oxygenation. After 11d of radiation exposure, the UR values in 18F-FDG imaging were (2.49±1.29) and (1.49±0.56), while the UR values were (2.22±0.45) and (1.89±0.08), expressing a coincident trend with 99Tcm-HL-91 imaging. This hint that the tumor metabolic sate was also decreased suggesting a good radiotherapy outcome. The primary clinical application with 99Tcm-HL-91 imaging was also proved successfully on the 3 patients with lung cancer. Their UR value were 1.72，2.63 and 1.93, respectively.Conclusion99Tcm-HL-91 UR value can effectively evaluate the tumor hypoxic level in vivo. This affords a new useful method to access the whole volume of tumor hypoxic level in clinic.
[Key words]Fluorodeoxyglucose F18; Emission-computed Tomography; 99Tcm-HL-91; Hypoxia; Tumor
肿瘤对人类健康的危害众所周知，其发病率及病死率已跃居各病首位，成为威胁人民健康和生命的主要疾病[1，2]。就肿瘤治疗而言，目前最有效的方法仍然是外科手术及放疗、化疗。这方面虽然取得了一些进展，但仍然没有达到治愈各种肿瘤的目的。就放疗而言，一些肿瘤治疗疗效没有明显的提高，实体瘤内乏氧现象的存在是其原因之一[3]。HL-91是一种新近开发的较为理想的乏氧组织显像剂，适用于SPECT显像，细胞培养和动物实验结果显示：肿瘤摄取水平与其乏氧程度呈良好的正相关[4]。 利用99Tcm-HL-91显像对病灶乏氧现象进行定性和定量检测，可动态检测肿瘤再氧合及预测放疗疗效，具有较其他乏氧检测技术更为突出的优势。18F 氟代脱氧葡萄糖(18F-FDG)是目前临床应用最多的肿瘤代谢显像剂，对肿瘤细胞进行分子水平显像。研究表明肿瘤18F 氟代脱氧葡萄糖代谢显像也可以很好地评价肿瘤的治疗效果[5]。本研究用99Tcm-HL-91作为乏氧显像剂，应用18F- FDG 符合显像探讨肿瘤放射治疗前、治疗中以及治疗后的乏氧状态与放疗疗效之间的关系，以期为临床应用99Tcm-HL-91提供实验依据，可以更好地为临床服务，帮助临床评价疗效，指导治疗方案。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物无特定病原体SPF 级小鼠由西安交通大学医学院实验动物中心提供并饲养，选取20只6 周龄健康雄性小鼠供实验用, 体质量为(27±3)g, 采用抽签方法随机分为两组，每组10只，另备5只用于腹水模型。
1.1.2细胞S180腹水瘤细胞株由西安交通大学医学院第一附属医院分子生物中心提供，复苏后分别接种于5 只小鼠腹腔，待腹水形成后(图1)，抽取1ml稀释至活瘤细胞计数大于2 ×106个/ml 瘤细胞悬液，于每只小鼠右后肢皮下接种0.2ml(图2)。待瘤体长至1～1.5cm 时，用于实验。
1.2方法
1.2.1动物模型显像
1.2.1.199Tcm-HL-91显像99Tcm -HL-91由广东希埃核医药中心提供。药物标记：取新鲜99mTcO4淋洗液(1.11~2.22GBq)加入HL91冻干品中使其溶解并充分震荡摇均,放置室温下15min,采用双体系检测放化纯度和标记率,标记率检测均大于95%。通过小鼠尾静脉注射99Tcm-HL91 37 MBq,4h后,分别于放疗前、放疗后1h、2天和10天进行显像。仪器采用美国GE Hawkeye VG SPECT系统，配以低能通用准直器，矩阵128×128，采集时间150s，放大1.3倍。
1.2.1.218F-FDG显像18F-FDG由广东希埃核医药中心提供，分别于放疗前和放疗后11天进行显像。显像前12h禁食，小鼠尾静脉注射18F-FDG 11.5MBq ，30min后腹腔注射0.1%戊巴比妥钠麻醉，仪器采用美国GE Hawkeye VG SPECT系统，配以高能符合线路准直器，矩阵128×128，采集时间150s，放大1.3倍。
1.2.1.3放射治疗第一次99Tcm-HL-91和18F-FDG显像结束后，对照组和实验组的小鼠分别给予0Gy和8Gy的X线加速器照射。
1.2.1.4图像处理和半定量分析使用仪器所带专用图形分析软件，于图像上肿瘤部位和小鼠肺野设等大感兴趣区(ROI)，获得显像中瘤/非瘤(T/NT)的摄取比值(uptaking ratio,UR)。
1.2.1.5统计学处理数据处理采用SPSS13.0软件，两样本均数比较的t检验，α=0.05作为检验水准。
1.2.2临床肺肿瘤患者显像
1.2.2.1药物制备(1) 99Tcm-HL-91的制备：无菌操作条件下，取HL-91冻干品1支，加入1110～2220MBq (2ml)新鲜99Tcm淋洗液;同时用4ml生理盐水溶解DTPA冻干品1支，迅速取出40μl(含氯化亚锡1.1μg)注入上述标记瓶中，摇匀后室温放置10min。采用双层析体系检测放化纯，(1)纸层析法：新华一号滤纸支持，甲醇展开;(2)硅胶G薄层层析：硅胶G板支持，生理盐水展开。放化纯大于90%。(2)99Tcm-MIBI的制备：无菌操作条件下，取MIBI冻干品1支，加入925～1850MBq(1~4ml)新鲜99Tcm淋洗液;密闭条件下置沸水浴加热12min，取出冷却至室温即可使用。采用聚乙酰胺层析，无水乙腈展开，放化纯大于90%。
1.2.2.2影像采集与处理(1)显像准备：检查当日患者清淡饮食，口服过氯酸钾400mg封闭甲状腺30min后，静脉注射99Tcm-MIBI 925 MBq进行肿瘤阳性显像，分别采集5min、60min前、后位平面像及60min SPECT/CT断层融合图像[79]，20~30min时进食脂肪餐以加速显像剂自胆囊排出。次日，再次注射99Tcm-HL-91 1110MBq 进行乏氧显像，分别采集2h、4h前、后位平面像及4h断层融合图像。(2)采集条件：使用低能高分辨准直器。平面显像：矩阵 256×256，能峰140keV，窗宽20%，Zoom=1.0，采集时间200s;断层显像：矩阵128×128，能峰、窗宽、放大倍数同上，双探头步进式旋转180°，每6°一帧，共采集30帧，采集时间(MIBI每帧25s;HL91每帧20s)，X线球管电压140kV，额定电流2.5mA，层厚10mm，共40层。(3)图像处理：断层采集数据经OSEM迭代重建后，使用GE专用Functional anatomical fusion 融合处理软件与CT图像进行融合，Hann 预滤波，截至频率0.7，重建滤波函数采用常规Ramp滤波，重建横断面、矢状面、冠状面SPECT/CT融合图像。(4)影像分析：视觉判断法：由两位有经验的核医学科医师和一名放射科医师同时对平面和断层融合图像进行阅片。由放射科医师对病灶部位和肺门、纵隔肿大淋巴结进行具体定位，然后在核医学图像相应的部位出现较周围组织高2个色阶者，认为肿瘤代谢活跃或明显乏氧。半定量分析法：在早期及延迟平面像及病灶最清晰(目测选择)的横断面上使用感兴趣区技术(ROI)勾画同等大小的感兴趣区，分别测量病灶区、对侧正常肺组织的平均计数值(count/pixel)。计算T/N比值。T/N=病灶ROI平均计数对侧正常部位同等大小ROI平均计数
2结果
2.1放疗前和放疗后1h、2天、10天99Tcm-HL-91的UR值见表1，显像结果见图1。结果表明：放疗后不同时相的UR值表现为依次递减趋势，而对照组各时相的UR值无明显递减趋势，甚至在2天时段出现UR值增高。表1放疗前和放疗后不同时相99Tcm-HL-91显像的摄取比值UR值
2.2放疗前和放疗后10天、11天18F-FDG显像的UR比值见表2, 显像结果见图2。UR值亦呈现依次递减趋势，与99Tcm-HL-91显像一致。而对照组的UR值也出现减低，但变化不明显，而且大部分小鼠在显像前死亡。表2放疗前和放疗后18F-FDG显像的摄取比值UR值
2.399Tcm-HL-91显像肺部肿瘤患者初步临床应用显像结果如图3所示。
3讨论
肿瘤乏氧是实体肿瘤的特性之一。实体肿瘤占人类肿瘤约90%以上。其中的肿瘤细胞可以通过浸润的方式侵犯临近的正常组织，也可以转移到其他器官继续生长。然而，无论是原位生长的肿瘤还是转移部位生长的肿瘤，当癌细胞增殖到一定程度后，它们就必须有自己的供血血管。通常情况下，癌细胞刺激临近组织的血管向肿瘤细胞群内部生长，这就是所谓的肿瘤血管生成。肿瘤组织内部的新生血管与正常血管相比有着很大的差异，它们无规律地曲折生长，有动静脉短路、盲端，缺乏平滑肌、神经纤维，内皮覆盖与基底膜也不完整。其中的血流无序而缓慢，导致肿瘤细胞得不到足够的氧和营养物质。在大多数肿瘤内部，氧分压都很低;其中一些区域甚至处于乏氧状态。国外有人做了氧扩散距离-乏氧细胞模型，他们观察到肿瘤细胞是以血管为中心呈环状排列，血管周围的细胞距离血管较近，氧和营养物质供应充分，细胞增殖迅速。在离血管半径超过200μm区，氧和营养物质缺乏，细胞大量坏死形成坏死区。由于这一区域距血管有一定距离，氧扩散的速率逐渐减慢，氧张力下降，导致这部分细胞氧供不足，即为乏氧细胞[6，7]。当肿瘤细胞生长的速度超过了其血管生长的速度，血供减少，局部肿瘤组织的氧分压随之降低，就形成了乏氧区域[8]。肿瘤细胞在乏氧环境中会产生一系列生理、生化改变。肿瘤乏氧是影响肿瘤放化疗疗效的主要原因。肿瘤乏氧是导致肿瘤放疗、化疗不敏感和导致复发和转移的重要因素。乏氧细胞具有其独特的生物学特性，这是乏氧细胞对治疗抗拒的根本原因。乏氧细胞大多处于细胞动力学的G0期，故趋于不增殖或增殖缓慢。分子生物学研究发现[9]，在乏氧状态下，细胞代谢、新基因的激活和蛋白的合成等过程都产生了明显改变，尤其是在动物中影响更大。其中血管内皮生长因子起着重要的作用，诱导血管周围内皮细胞增殖，这些内皮细胞经过一系列复杂的变化最终形成血管，进入到肿瘤球体，并给肿瘤提供营养和氧，以保证其不断生长。随着肿瘤的生长，不断地产生愈来愈多的新生血管，并可接通正常组织血管，吸收营养，使血管周围的细胞乏氧，并最终发生坏死。进而影响了乏氧诱导生长因子(HGF21a、HGF22a)、血管内皮生长因子 (VEGF)和细胞分裂周期蛋白的表达，从而影响肿瘤的表达，导致肿瘤细胞对放疗及化疗的抗拒，从而大大地降低射线和某些化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力，不能达到理想的治疗效果。乏氧不仅使肿瘤产生针对放、化疗的保护蛋白，从而增加对放、化疗的抵抗性;而且使肿瘤内氧调节蛋白(ORP)、血管内皮生长因子(VEGF)等表达增加，使肿瘤自身的侵袭性也增加[6,8]。乏氧细胞降低了肿瘤的放疗敏感性。通过对肿瘤细胞的增殖周期的研究发现乏氧能特异地抑制早S期DNA复制的启动，当细胞发生再氧合时，DNA复制能够在数分钟内恢复。当肿瘤乏氧时，肿瘤内的血管内皮生长因子(VEGF)表达增多，促使肿瘤血管增生，致乏氧期间处于S期的细胞再氧合，引起DNA的复制，放射抗拒基因的合成增多而使肿瘤对放射治疗的抗拒性增加[10]。另有学者通过对肿瘤凋亡的研究发现，乏氧时引起的细胞凋亡较有氧时少，由于乏氧诱导的和放化疗诱导的凋亡基因是一样的，因此乏氧通过降低凋亡潜能细胞的选择作用引起对放射治疗和化疗的抗拒性[11]。肿瘤细胞在急、慢性缺氧微环境中可对肿瘤的放射治疗效果产生重要的影响，乏氧现象的存在导致放疗中对电离辐射 (X线或γ线 )的耐受。体外培养细胞接受电离辐射后的存活曲线显示乏氧细胞对电离辐射耐受[12]。在头颈肿瘤和转移淋巴结对放疗的效应中也显示了相似的肿瘤乏氧效应[13]，Suzuki等[14]体外研究表明肿瘤细胞的乏氧状态对放疗的应答密切相关;同时发现肿瘤组织对99Tcm-HL-91的摄取并不总是与放疗敏感性有关，照射后肿瘤组织内摄取的增加预示放疗疗效较差，而放射中摄取的降低或变化不大则预示放疗可能有效。研究中放疗前后肿瘤动物模型的HI-91显像结果显示，观察发现99Tcm-HL-91主要聚集在小鼠肿瘤乏氧病灶中，能清楚地显示肿瘤病灶的乏氧状态，本组小鼠放疗前和放疗后1h、2天、10天HL-91的UR值分别为(3.53±1.62)、(3.41±1.42)、(2.55±1.57)和(1.26±0.03)。很显然放疗前和放疗后不同时相的UR值表现为依次递减趋势;表明肿瘤经放射治疗后, 肿瘤较前缩小, 肿瘤内部及周边微循环改善, 乏氧细胞减少, 从而乏氧程度得到改善。对照组各时相的UR值分别为(3.62±1.65)、(3.02±1.94)、(4.10±1.48)和(2.96±2.02)，UR值无明显递减趋势，表明肿瘤乏氧状态未见减低，甚至在2天时段出现加重。这一结果与文献报导基本一致。姚稚明[15]等研究发现，99Tcm-HL-91在裸鼠癌灶低氧区明显摄取;99Tcm-HL-91摄取率与癌灶的血流灌注负相关，它主要浓聚于病灶的乏氧组织，而不是在血流丰富区及坏死区。谢新立等[16]也发现 99Tcm-HL-91能明显聚集在肺癌乏氧组织中，癌灶乏氧程度不同，其恶性程度也不一样，乏氧程度越高，疗效越差。放疗后肿瘤出现再氧合，乏氧状态依次减低，而在有氧存在的条件下，射线对肿瘤的辐射生物学效应会增强，肿瘤细胞对放射治疗会更敏感，有利于肿瘤的治疗。对照组各时相的UR值无明显递减趋势，说明肿瘤乏氧状态无明显变化，甚至在2天时段还出现乏氧加重。提示在未进行放射治疗的前提下，肿瘤持续进展。这也充分证明 99Tcm- HL-91 显像能较好地反映放疗前后小鼠癌灶乏氧程度的改变。放疗前后肿瘤动物模型的18F-FDG显像结果显示：本组小鼠放疗前和放疗后11天 18F-FDG显像的UR比值分别为(2.49±1.29)和(1.49±0.56), UR值亦呈现依次递减趋势，说明放疗后肿瘤的葡萄糖代谢活性减低，提示放射治疗有效地降低了肿瘤的代谢和增值水平。对照组的UR值分别为(2.22±0.45)和(1.89±0.08)，UR值也出现减低，虽然对照组18F-FDG显像的UR值也出现减低趋势，但变化不明显，无统计学意义。而且大部分小鼠在显像前死亡，说明肿瘤进展。这一结果同样与文献报道较为一致，Yamamoto 等[17]发现，18F-FDG PET对非小细胞肺癌放化疗后 的 UR值及UR变化百分比均与术后病理确诊的肿瘤退缩有显著性联系, 即肿瘤退缩越明显，放化疗后 UR 值越低;同时，UR变化百分比越大。恶性肿瘤细胞增生活跃，其葡萄糖氧化分解和无氧酵解均明显高于正常组织，18F-FDG是一种天然葡萄糖的类似物，在注入体内后，18F-FDG与葡萄糖一样通过细胞膜上葡萄糖转运蛋白(glucose transporter, Glut)，如Glut-1、Glut-2、Glut-3等转送进入细胞内。18F-FDG进入细胞后在己糖激酶(hexokinase)的作用下被磷酸化形成6-磷酸-18FDG(6-P-18FDG)，但与葡萄糖不同的是，6-P-18FDG不能再继续分解、利用而陷落在细胞内，成为一种良好的功能、代谢性示踪剂，且18F-FDG在细胞内的浓聚程度与细胞内葡萄糖的代谢水平高低呈正相关[18]。恶性肿瘤细胞的代谢特点之一是高葡萄糖代谢，故能聚集18F-FDG 。本研究中肿瘤细胞摄取18F-FDG的可能机制与下述有关：肿瘤细胞膜上葡萄糖转运蛋白表达增加，如Glut-1、Glut-2、Glut-3等;肿瘤细胞内己糖激酶活性增高;葡萄糖-6-磷酸酶活性低(该酶可使6-P-18FDG去磷酸化而释出细胞外)等。肿瘤缺氧可以增加18F-FDG的聚集，证明它是既可以通过葡萄糖代谢改变评价放疗效果，也可以间接反映肿瘤的乏氧水平。肺肿瘤患者99Tcm- HI-91显像结果提示，大约在注射显像剂后2h左右，不论是平面显像还是断层显像，肺肿瘤患者的病灶乏氧状态都能得到良好显示，断层显像的UR值最高达到2.63。在时相上非常有利于临床常规操作，在UR值的结果上，也特别有利于影响结果的视觉评价和半定量分析。这些均提示：用99Tcm- HI-91在活体水平评价肿瘤乏氧水平具有良好的应用潜质。(本文彩图见封二)
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