丹参单体对TNF-α诱导大鼠动脉平滑肌细胞MCP-1和IL-1β的影响

    丹参单体对TNF-α诱导大鼠动脉平滑肌细胞MCP-1和IL-1β的影响 (pdf)

    【摘要】  目的  观察丹酚酸B和丹参酮ⅡA对肿瘤坏死因子（TNF-α）诱导的血管平滑肌细胞（SMC）白细胞介素-1β（IL-1β）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的影响，探讨丹参单体抗动脉粥样硬化（AS）的作用机制。方法  体外培养大鼠主动脉SMC；RT-PCR法检测SMC MCP-1 mRNA的表达；放免法检测SMC培养上清IL-1β的水平。结果  TNF-α促进SMC MCP-1mRNA的表达，提高IL-1β水平(P值均<0.01)。两种丹参单体均抑制上述因子的表达，其中，对于抑制MCP-1mRNA的表达以丹参酮ⅡA效果更佳。结论  丹参单体抗AS作用的机制之一是抑制炎症相关因子的表达，丹参酮ⅡA抗炎效果优于丹酚酸B。

    【关键词】  肿瘤坏死因子；单核细胞趋化蛋白1； 白细胞介素-1β；丹酚酸 B；丹参酮ⅡA

      Effect of salvia miltiorrhiza monomer on expression of monocyte chemotactic protein-1 and interleukin-1β in cultured rat vascular smooth muscle cells induced by tumor necrosis factor α

    JIANG Xi-juan, ZHAO Gui-feng, LU Bin,et al. Department of Pathology， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300192， China

    【Abstract】  Objective  To observe the effect of salvianolic acid B and tanshinone ⅡA on monocyte chemotactic protein-1 and interleukin-1β in cultured smooth muscle cells induced by TNF-α and to investigate the molecular mechanism of salvia miltiorrhiza monomer against atherosclerosis.Methods  Rat aortic smooth muscle cells (SMC) were cultured， the mRNA expression of MCP-1 was observed by RT-PCR. Interleukin-1β was measured by radioimmune assay methods.Results  The expression of MCP-1 mRNA was stimulated by TNF-α and IL-1β was significantly increased（P<0. 01）. Both of the salvia miltiorrhiza monomer markedly reduced the expression of MCP-1 mRNA and IL-1β， compared with control group(P<0. 01 and P< 0.05 respectively ).Tanshinone ⅡA had better effect in the expression of MCP-1 mRNA than salvianolic acid B. Conclusion  One of the molecular mechanism of salvia miltiorrhiza monomer resists atherosclerosis was inhibition expression of inflammation-related factor in SMC. Tanshinone ⅡA had better effect in anti-inflammation than salvianolic acid B.

    【Key words】  tumor necrosis factor α； monocyte chemotactic protein-1； interleukin-1β； salvianolic acid B； tanshinoneⅡA

    丹参是临床防治动脉粥样硬化（AS）的常用药物，它含有多种有效成分，可以通过不同途径达到防治AS的目的。但是，丹参成分复杂，主要分为水溶性成分和脂溶性成分，推测不同有效成分的靶点有所不同。其中丹酚酸B是其主要水溶性成分，而丹参酮ⅡA是其主要脂溶性成分。为了阐明二者抗AS的作用靶点，我们用体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞( SMC)，观察丹酚酸B和丹参酮ⅡA对TNF-α诱导的IL-1β和MCP-1的影响，为其抗AS作用提供新的理论依据。

    1  材料

    1.1  主要试剂  DMEM/F12培养基（GIBCO）、胎牛血清（GIBCO）、VSMCα-actin单克隆抗体（日本长野癌症研究中心惠赠）。总RNA提取试剂盒、100bp DNA LADDER（清华天为时代）、MCP-1引物（中科院华大基因公司）、β－actin引物、RT-PCR试剂盒（大连宝生物公司）、IL-1β放免分析试剂盒（北京东亚放免技术研究所）。

    1.2  主要仪器和设备  超净工作台、CO2恒温培养箱（TC 2323美国SHLAB）、酶标仪（TACAN SPECTRA III）、倒置显微镜（XD-101 98010）、PCR仪（HYBAID）、核酸蛋白分析仪（DU530 BECKMAN）、台式高速离心机（HERAEUS公司biofuge）、电泳仪（DYY-III-8B 北京六一仪器厂）、Bio imaging system（SYNGENE公司）γ 放射免疫计数器（GC-400型，中国科技大学科技实业总公司中佳光电仪器分公司）等。

    1.3  实验用药  丹酚酸B、丹参酮ⅡA（标准品，科翔生物科技有限公司）和大鼠TNF-α（英国PEPROTECH公司）。

    2  方法

    2.1  大鼠动脉平滑肌细胞培养与鉴定  选用清洁级Wistar大鼠，雌雄不限，体重150g左右（购于军事医学科学院四所）。动物脱臼处死，无菌条件下将主动脉取出，立即放入D-hanks液中，洗去残留血迹，剔除血管外膜纤维脂肪层，刮除内膜，并反复冲洗血管。将血管剪成1mm2左右小块，均匀接种于25cm2培养瓶内，37℃恒温培养箱内干孵1.5～2h后，每个培养瓶内加入5ml含20％胎牛血清的DMEM/F 12培养液。培养5天后细胞从组织块内长出，并更换新鲜培养液继续培养，10天后，细胞长成“峰”、“谷”交错的致密细胞层时，进行传代。实验采用第四代细胞。鉴定：根据细胞形态（典型的梭形，可重叠生长至多层，高低起伏形成“峰”、“谷”交错状）和VSMC α-actin免疫组化染色（培养细胞呈明显的胞浆阳性表达）。

    2.2  造模及分组方法  取生长良好的平滑肌细胞，换用无血清培养基培养12h，进行同步化后，分别进行如下处理。

    2.2.1  正常组（N）  采用无血清培养基继续培养8h。

    2.2.2  模型组（M）  采用无血清培养基继续培养2h后，再加入10ng/ml TNF-α作用6h。

    2.2.3  丹酚酸B组（B）  加入1mg/L丹酚酸B预处理2h后，再加入10ng/ml TNF-α作用6h。

    2.2.4  丹参酮ⅡA组（ⅡA）  加入2mg/L丹参酮ⅡA预处理2h后，再加入10ng/ml TNF-α作用6h。

    2.3  指标检测

    2.3.1  RT-PCR法检测动脉平滑肌细胞MCP-1 mRNA的表达

    2.3.1.1  总RNA提取  采用异硫氰酸胍一步法（AGPC），A260/A280>1.8，RNA置于-70℃备用。

    2.3.1.2  逆转录反应（RT）  从-70℃取出RNA进行反应。参数：42℃、30min，99℃、5min，5℃ 、5min。

    2.3.1.3  PCR反应  引物序列，看家基因β－actin，上游引物5′TTGTAACCAACTGGGACGATATGG 3′， 下游引物5 ′GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG 3′； MCP-1， 上游引物5′CAGGTCTCTGTCACGCTTCT 3′， 下游引物5 ′AGTATTCATGGAAGGGAATAG 3′。参数：94℃预变性2min， 94℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，30次循环。

    2.3.1.4  MCP-1mRNA表达分析  各样品取10μl PCR扩增产物，进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果拍照（图1）保存并在Bioimaging凝胶成像系统上进行吸光度扫描( IOD) 分析，以各样品MCP-1条带IOD 和相应的β-actin 条带的IOD 比值表示MCP-1mRNA 表达的强弱。

    2.3.2  培养平滑肌细胞上清IL-1β水平的测定  取细胞上清液采用放射免疫平衡法测定IL-1β水平，操作按试剂盒说明书进行。

    2.4  统计学方法  SPSS11.0进行方差分析，组间比较，q检验。

    3  结果

    3. 1  丹参单体对TNF-α损伤血管平滑肌细胞MCP-1 mRNA表达的影响  通过RT-PCR发现：TNF-α诱导SMC MCP-1 mRNA表达，与对照组相比差异有显著性，P<0.01。 丹参酮ⅡA和丹酚酸B对上述因子的表达存在显著性抑制作用，与模型组相比，P值分别<0.05和<0.01。其中，丹参酮ⅡA对MCP-1 mRNA表达的抑制作用强于丹酚酸B，P<0.05（表1，图1）。图1  各组平滑肌细胞MCP-1 mRNA的表达（由左向右：N、B、M 、ⅡA）表1  丹参单体对TNF-α损伤SMC MCP-1 mRNA表达的影响  （略）注:与模型组比较：**P<0.01，*P<0.05；与丹参酮ⅡA组比较,★P<0.05

    3.2  丹参单体对平滑肌细胞炎症介质IL-1β的影响  结果显示，TNF-α诱导SMC IL-1β表达，与对照组相比差异有显著性，P<0.01。丹参酮ⅡA和丹酚酸B降低SMC上清IL-1β水平，与模型组相比，P值分别<0.05和0.01，丹参酮ⅡA和丹酚酸B之间差异没有显著性，P>0.05（表2）。表2  丹参单体对平滑肌细胞炎症介质IL-1β表达的影响  (略) 注：与模型组比较，**P<0.01，*P<0.05

    4  讨论

    AS被视为一种特殊类型的炎症，单核细胞粘附于血管壁并穿入内皮下形成泡沫细胞是其重要形态学特征。单核细胞进入血管内膜下是AS早期事件并贯穿其全过程，MCP-1是介导上述过程实现的主要因子［2，3］。MCP-1 在正常血管壁中几乎未表达，而在AS不同演变时期中MCP-1 表达均有升高。

    虽然在正常情况下，SMC不产生MCP-1，但是在AS发展过程中，SMC不仅可作为MCP-1的效应细胞，而且还可自行合成与分泌MCP-1而影响其他细胞的功能［4］。动物实验发现［5］，不同阶段AS病变组织中均有大量MCP-1mRNA表达，其中VSMC内MCP-l及MCP-1受体mRNA表达呈阳性；并且随着病变时间延长、病变程度加重，MCP-1蛋白及其mRNA的表达均逐渐增强。MCP-1是VSMC的促分裂因子，它通过PKC或增强细胞外Ca2+内流而促进VSMC增殖和迁移［6］。在病理状态多种物质及细胞因子（如IL-1β）可以诱导SMC分泌MCP-1，从而直接或间接地参与AS形成。而吴强［7］等用逆转录病毒表达载体介导反义MCP-1转基因表达，能减少MCP-1表达并抑制单核细胞在动脉内膜粘附，为AS防治提供了一个新的研究线索。

    另外，VSMC可通过自分泌和旁分泌方式释放细胞因子IL-1，而且IL-1β的水平远高于IL-1α。IL-1β具有多种生物学功能，它不仅能作用于血管内皮细胞，诱导其MCP-1和VCAM-1的表达，而且能与PDGF或单核细胞源性生长因子共同作用促进VSMC增生。以浓度和时间依赖方式诱导单核细胞和中性粒细胞对VSMC的粘附［8］。动物实验表明IL-1β对兔主动脉VSMC MCP-1的蛋白分泌和mRNA表达具有明显的诱导作用 ［9］。因此，推断IL-1β的表达增加可以间接促进MCP-1的表达。

    本实验离体培养大鼠VSMC，采用炎症反应主要调节因子TNF-α进行干预，通过RT-PCR法检测发现SMC MCP-1mRNA表达增加，SMC培养上清IL-1β水平升高，与以往报道相一致［5］。丹参酮ⅡA和丹酚酸B对上述因子的表达具有明显抑制作用，其中以脂溶性成分丹参酮ⅡA的效果更好。另外，通过放免法发现，两种丹参单体对IL-1β也有抑制效应，而且与对MCP-1的影响相一致，推断丹参单体可能通过抑制IL-1β达到间接抑制MCP-1的目的。由此可见丹参单体具有抑制炎症因子表达的作用，其抗AS的机制之一可能是通过抑制炎症反应达到抑制SMC增殖和单核细胞趋化等效应，达到减缓AS发生发展的目的；结果同时提示丹参成分复杂，其不同成分对上述炎症因子的影响不尽相同，其中以脂溶性成分丹参酮ⅡA的效果更好。

    【参考文献】

    1  李俊峡. 作为炎症性疾病的冠状动脉硬化. 日本医学介绍，2005， 26(6):278.

    2  DeGraba TJ， Siren AL， Penix L，et al. Increased endothialial expression of intercellular adhesion  molecule21 in Symptom2 atic versus asymptomatic human carotid atherosclerotic plaque. Stroke， 1998， 29 (7): 1405-1410.

    3  O’Brien KD， Allen MD， Mcdonald TO，et al.Vascular cell adhesion molecule21 expressed in human coronary atherosclerotic plaques: inplication for the mode of progression of advanced coronary atherosclerosis. J Clin Invest， 1993， 92 (2): 945-951.

    4  Nelken NA，Coughlin SR，Cordon D，et al.Monocyte chemoattractant protein-1 in human athermatous plaques.J Clin Invest，1991，88:121-127.

    5  崔华，何作云.不同阶段食饵性动脉粥样硬化兔血管壁核因子κB活化和单核细胞趋化蛋白l与蛋白激酶C表达的变化.中国动脉硬化杂志，2002，10（4）：212－215.

    6  SkikciO，Nesrin K，Ozer AA.Dietary cholesterol-induced changes of protein kinase C and the effect of vitamin E in rabbit aoric smooth muscle cells.Atherosclerosis,1996，126:253-263.

    7  吴强，乔绘红，王宗立,等．反义单核细胞趋化蛋白-l转基因表达对单核细胞在动脉内膜粘附的影响．中华病理学杂志，2000，  29(2)：107-110.

    8  Wang X，Feuerslein GZ，Clark RK，et al.Enhanced leucocyte adhesion to interleukin-1 beta stimulated vascular smooth muscle cells is mainly through intercellular adhesion molecule-1.Cardiovasc Res，1994，28:1808.

    9  阮秋蓉，宋建新，邓仲端.白细胞介素1β对兔主动脉平滑肌细胞MCP-1及VCAM-1蛋白及mRNA表达的影响.同济医科大学学报，1999，28（5）：357－359.

    *基金项目：天津市自然科学基金项目（编号：023611611）

    作者单位：1 300192 天津，天津中医药大学病理教研室（Δ实验教学部，ΔΔ指导）

    2 天津，天津中医药大学第一附属医院

　(编辑：宋  冰)