电针对力竭运动大鼠骨骼肌α-肌动蛋白基因表达的影响

【摘要】  目的 研究电针刺激对一次性力竭运动大鼠骨骼肌α-肌动蛋白基因表达的影响，初步探讨电针刺激提高运动能力、延缓运动性疲劳发生的分子生物学机理。方法 40只SD雄性大鼠分为4组（对照组、模型组、力竭组、电针组），对照组大鼠常规饲养3周后处死取材；其他三组进行3周的游泳训练，模型组大鼠在游泳训练后处死取材；力竭组大鼠在游泳训练后进行一次性力竭游泳后处死取材；电针组大鼠在游泳训练后进行一次电针刺激，然后进行一次性力竭游泳，力竭游泳后处死取材。记录力竭游泳时间，用RT-PCR方法测定骨骼肌α-肌动蛋白基因表达。结果 电针组的平均力竭游泳时间明显长于力竭组；模型组大鼠的骨骼肌α-肌动蛋白基因表达明显高于对照组和力竭组；电针组的α-肌动蛋白基因表达虽低于模型组，但高于力竭组和对照组。结论 （1）3周游泳训练可以提高大鼠骨骼肌α-肌动蛋白的基因表达；（2）电针刺激有助于促进力竭运动大鼠的骨骼肌α-肌动蛋白基因的表达，延长大鼠力竭游泳时间，提高大鼠的运动耐力，延缓运动性疲劳的发生。

【关键词】  电针；肌动蛋白；力竭运动

    Effects of electroacupuncture on expression of α-actin mRNA induced by exhausted exercise in skeletal muscles of rats

    YANG Hua-yuan，SHU Ya.Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai  201203,China

    【Abstract】  Objective  To observe the effects of electroacupuncture on expression of α-actin mRNA induced by exhausted exercise in skeletal muscles of rats, and explore the molecular biological mechanisms of electroacupuncture in delaying the occurrence of exercise-induced fatigue.Methods  Forty male SD rats were randomly divided into four groups（control group; model group; exhausted exercise group; electroacupuncture group）. Control group was killed after raising for 3 weeks; other 3 groups were trained to swimming for 3 weeks, then model group was killed ; and electroacupuncture group were treated with electroacupunctrue before exhausted exercise; while exhausted exercise group attended exhausted exercise directly. Then the exhausted time was noted, and the expression of α-actin was tested by RT-PCR.Results  The mean time of exhausted swimming in electroacupuncture group was longer than that in exhausted exercise group. The skeletal muscle expression of α-actin mRNA in model group was obviously higher than that in control group and in exhausted exercise group; although the expression in electroacupuncture group was lower than that in model group, it’s higher than that in exhausted exercise group and in control group.Conclusion  （1）The expression of α-actin mRNA in skeletal muscle could be increased after 3 weeks’ swimming train；（2）compared with exhausted exercise group, electroacupuncture treatment before exhausted exercise could increase the expression of α-actin mRNA, and also increase the exhausted swimming time. So electroacupuncture treatment may increase the sports capacity and delay the occurrence of exercise-induced fatigue by regulating the expression of α-actin mRNA in skeletal muscle.

    【Key words】  electroacupuncture; α-actin; exhausted exercise

    近年来，针灸在竞技体育领域的应用和研究已获得一定的进展，随着研究的不断深入，针灸作为一种简便有效的治疗方法，在延缓运动性疲劳方面的优势逐渐显现，引起了运动医学工作者的广泛关注。运动性疲劳的发生机制涉及到多方面的原因，而针灸对其延缓作用的机理尚未阐明。因此，本研究旨在观察电针刺激对力竭运动后大鼠骨骼肌α-肌动蛋白（α-actin, ACTA1）基因表达的影响，探讨电针刺激延缓运动性疲劳的分子生物学机理，为针灸延缓运动性疲劳提供理论依据。

　　1  实验材料与方法

    1.1  实验动物  清洁级健康成年SD雄性大鼠40只，体重160g左右，由上海中医药大学实验动物中心提供，经适应性饲养1周后进入实验。标准啮齿动物饲料喂养，自由进食饮水，室温22℃。

    1.2  主要仪器设备  BX型电针仪（上海市针灸经络研究所研制）；JB50-D型增力电动搅拌机（上海标本模型厂）；UV754N紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器设备有限公司）；PTC-100型PCR仪（MJ RESEARCH 公司）；DYY-7C型电泳仪（北京六一仪器厂）；FR-200紫外可见分析装置（上海复日科技公司）等。

    1.3  主要实验试剂  RNAiso reagent（大连takara生物工程公司）；M-MLV反转录酶（200U/μl）（美国invitrogen公司）；RNAsin（40U/μl）（美国invitrogen公司）；Taq聚合酶（上海申能博彩公司）；Oligo dT18引物（100uM）（上海申能博彩公司）；α-肌动蛋白引物（大鼠）（上海申能博彩公司合成）；β-肌动蛋白引物（大鼠）（上海申能博彩公司合成）。

    1.4  实验方法

    1.4.1  分组和建模  40只大鼠经适应性游泳3天后随机分为4组： 对照组（A）、模型组（B）、力竭组（C）、电针组（D），每组10只。除空白组外，其余大鼠从第4天开始正式游泳训练，训练时无负重游泳，第1周游泳时间从30min/d开始逐渐延长至60min/d，之后第2周和第3周游泳60min/d，隔天游泳1次。除模型组外，其余2组大鼠在第3周游泳后休息2天，进行无负重一次性力竭游泳运动，观察游泳过程中大鼠的行为并记录游泳时间。力竭标准：游泳动作明显失调，不能再坚持，沉入水底5s不能回到水面［1］。

    1.4.2  刺激方法  电针组大鼠在一次性力竭游泳运动前进行电针刺激。穴位选择［2］：后足三里，膝关节后外侧，在腓骨小头下约5mm处；阳陵泉，距后足三里上外侧5mm处。方法：一次性针灸针（华佗牌）30号0.5寸刺入穴位5mm，接上电针仪，选择音频脉冲调制波，频率为800Hz。刺激强度以大鼠趾端或局部出现轻微震颤为度，刺激时间20min。

    1.5  组织取材  对照组于3周饲养结束后处死，模型组在3周游泳训练结束处死，力竭组及电针组在一次性力竭运动后即刻处死。迅速取出后腿肌肉，用锡纸包好速冻于液氮中，然后转移至-80℃低温冰箱中保存备用。

    1.6  α-肌动蛋白基因表达的测定

    1.6.1  组织RNA抽提方法  采用Takara的RNAiso Reagent操作说明（D312）。将肌肉室温下解冻，取骨骼肌组织块80～100mg（除去筋膜、肌腱）加入1ml RNA iso液，用增力电动匀浆器快速匀浆；室温下静置5min；加入氯仿0.2ml，充分混匀，室温下静置3min；4℃×14000r/min离心15min；小心吸取上清液0.45ml移入另一1.5ml无酶离心管中；加入等体积0.45ml 异丙醇，混匀；室温下静置10min；4℃×14000r/min离心10min；弃上液，加入1ml 4℃ 75%乙醇；4℃×10000r/min离心5min；吸弃上清液，真空干燥5min；用20μl DEPC处理水溶解，-70℃保存。

    1.6.2  反转录  dNTP（10mM） 2μl；5×buffer 4μl；DTT（100mM） 1μl；RNAsin（40U/ul）  1ul；OligodT（18s）（0.1μg/μl） 1μl；组织总RNA 2μg；余用加水补足至18μl；65℃水浴5min，快速插入冰水中，然后依次加入：RNAsin（40U/μl）1μl；M-MLV反转录酶（200U/μl）1μl；37℃水浴60min，75℃水浴15min（灭活逆转录酶）。-20℃保存。

    1.6.3  PCR反应及电泳  dNTP（each 2.5mM） 2μl；10×buffer 4μl；α-actin/β-actin引物（5uM）各1μl；反转录产物1μl；TagDNA聚合酶（5U/μl）0.4μl；最后加水至 40μl。α-actin引物：正义链5’-AAGTGCGACATCGACATCAGG -3’，反义链5’-CTTCCACAGGGCTTTGTTTGA -3’；β-actin作内参照，正义链5’-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3’，反义链5’-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATGGAGG-3’。PCR反应条件为：94℃ 3min；94℃ 40s；55℃ 1min，72℃ 1min，35个循环；最后72℃下延伸反应5min，4℃保存。

    取适量PCR产物进行凝胶电泳，用FR-200紫外可见分析装置观察电泳结果，并拍照进行光密度扫描，分别计算α-actin与β-actin的光密度比值，并用此比值表示α-actin的相对表达值。

    1.7  统计学方法  数据处理采用SPSS 12.0软件,单因素方差分析（α-actin）和两样本t检验（力竭游泳时间）。

　　2  实验结果

    2.1  力竭组与电针组大鼠平均力竭游泳时间比较  见表1。经过两样本t检验后，表明力竭组大鼠平均游泳时间明显高于力竭组（P<0.01）。

    2.2  4组大鼠肌动蛋白电泳图片比较  见图1～4。表1  力竭组与电针组大鼠力竭游泳时间 注：*大鼠在3周训练中溺死剔除样本

    2.3  电针对力竭运动大鼠骨骼肌α-actin基因表达的影响  见表2及图5。表2  4组大鼠骨骼肌α-actin基因表达的比较注：与力竭组相比，★P<0.05；与空白对照组相比，●P<0.05

    3周游泳训练结束后，模型组大鼠的骨骼肌α-actin基因表达明显高于对照组和力竭组，差异有统计学意义（P<0.05）；电针组的α-actin基因表达虽低于模型组，但高于力竭组，差异具有统计学意义（P<0.05）。

    3  讨论

    肌动蛋白（actin）是真核细胞中一种重要蛋白质，它参与几乎所有形式的细胞及细胞器的运动，特别是作为一种收缩蛋白在骨骼肌的活动中发挥重要作用。运动性疲劳的产生是多因素、多基因综合调控的结果，而这一过程中，各种分子功能的调控不是简单和独立的。

    本实验通过电针穴位刺激观察力竭运动大鼠骨骼肌α-actin基因表达的影响，探讨电针穴位刺激延缓运动性疲劳的作用机理。实验结果发现，3周游泳训练后大鼠骨骼肌α-actin基因表达量明显高于未接受游泳训练的对照组，说明运动训练可以促进骨骼肌α-actin基因表达［3～5］。力竭组大鼠与模型组大鼠相比，α-actin基因表达明显下降。值得注意的是，电针干预后的大鼠平均力竭游泳的时间远长于单纯力竭组大鼠，这表明电针穴位刺激可以提高大鼠运动耐力，延缓运动性疲劳发生，其实验结果与文献报道一次力竭性运动后大鼠股四头肌α-actin的基因表达明显下降，而针刺可以促进运动后大鼠股四头肌α-actin基因表达的恢复相一致［6］。与模型组大鼠相比，电针组和力竭组大鼠的α-actin基因表达均下调，但电针组α-actin基因表达量高于单纯力竭组大鼠，此两者之间差异具有统计学意义。力竭运动大鼠可以引起α-actin基因表达下降，而电针刺激可以相对提高骨骼肌α-actin基因表达，这可能是电针提高大鼠运动能力，延缓运动性疲劳发生的可能机制之一。因此，α-actin基因表达增高可以促进α-actin合成，引起骨骼肌代偿性肥大，肌力增强［7］。但也有研究表明［8］，α-actin基因调节肌力不是仅依赖于α-actin蛋白的合成，尚存在其他途径来调节和影响肌力强弱，这一机制还需要作进一步的评价。

    我们的实验以α-actin为切入点，观察运动性疲劳、电针和α-actin三者之间的关系。从α-actin基因表达入手，探讨电针刺激延缓运动性疲劳发生的作用机制，我们发现这一机制与骨骼肌α-actin基因表达变化存在一定的相关性，表明了电针刺激可以延缓运动性疲劳的发生。由于我们只是观察了单个基因在运动性疲劳中的表达变化，所以无法从整体上观察电针干预力竭的大鼠或单纯力竭大鼠骨骼肌的整个表达谱变化。随着系统生物学的发展，众多高新技术的应用，可以帮助我们更深入地了解针灸作用机理和针灸延缓运动性疲劳的机制。

【参考文献】
  1 李靖, 李皓, 张蕴琨. 耐力训练对力竭运动诱导的大鼠淋巴细胞凋亡的影响. 中国运动医学杂志, 2005，24（2）: 160-164.

2 林文注, 王佩. 实验针灸学. 上海: 上海科学技术出版社, l999，288.

3 Morrison PR, Biggs RB, Booth FW. Daily running for 2 wk and mRNAs for cytochrome c and α-actin in rat skeletal muscle. Am J Physiol，1989，257（5 Pt 1）: C936-939.

4 彭金柱, 王瑞元. 2周耐力训练对大鼠骨骼肌肌动蛋白和肌球蛋白重链基因表达的影响. 中国运动医学杂志, 2005，24（4）:415-418.

5 冯连世. 优秀中长跑运动员高原训练的生理适应以及模拟高原训练时骨骼肌α-肌动蛋白的基因表达. 北京: 北京体育大学,1998.

6 王瑞元, 苑玉和, 冯炜权. 一次力竭性离心运动后大鼠骨骼肌-actin基因表达及针刺对其影响. 北京体育大学学报, 2002，25（2）:189-190,221.

7 Mozaffar T, Haddad F, Zeng M, et al. Molecular and cellular defects of skeletal muscle in an animal model of acute quadriplegic myopathy. Muscle Nerve，2007，35（1）:55-65.

8 Thompson LV, Durand D, Fugere NA, et al. Myosin and actin expression and oxidation in aging muscle. J Appl Physiol，2006，101（6）:1581-1587.

作者单位：201203 上海，上海中医药大学