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【摘要】 目的 建立复发性口疮（RAU）家兔动物模型，探讨锡类散缓释贴膜对RAU家兔TNF-α、IL-1表达的影响。方法 家兔脊柱两侧皮内注射家兔口腔黏膜抗原乳化液，造模后将溃疡家兔随机分成三组，一组空白模型组，一组为模型治疗组，一组为模型散剂组，固定家兔口腔，分别将贴膜敷之溃疡面上和散剂吹撒溃疡面上。连续用药5天，检测给药后家兔RAU炎性细胞因子TNF-α、IL-1表达水平。结果 实验动物出现口腔黏膜溃疡，于最后一次抗原注射10天后口腔溃疡开始增多。模型治疗组和模型散剂组炎性细胞因子TNF-α、IL-1表达水平均明显降低。结论 锡类散缓释贴膜及锡类散对RAU家兔具有治疗作用，其机制可能主要是通过减少炎性细胞因子的分泌。
【关键词】 锡类散缓释贴膜；复发性口疮；TNF-α；IL-1
Effects of xilei oral sustained-release mucoadhesive films on expression of TNF-α,IL-1 in RAU rabbits models
WANG Jin，WANG Xiao-ping.Jiangxi College of Chinese Medicine,Fuzhou 344000,China
［Abstract］ Objective To study the effect of xilei oral sustained-release mucoadhesive films and its possible mechanism in RAU rabbits.Methods RAU model was established by injecting the back of rabbits with galacta of rabbits's oral mucosa，0.5 ml，once per two weeks，treated for 10 weeks.The ulcerative rabbits were divided into three groups：group one was established model and do nothing，group two received xilei oral sustained-release mucoadhesive films，group three received xilei oral,once a day for 5 days in group two,three.The expression of TNF-α,IL-1 in inflamed tissue of each group was measured at the end of experiment.Results The experimental rabbits appeared the oral ulcer，the ulcer grew in number after 10 days of the last antigen injection.There were lower level of TNF-α，IL-1 in inflammatory tissue in group two and three.Conclusion Treatment with xilei oral sustained-release mucoadhesive films and xilei oral has beneficial effect in RAU rabbits.The mechanism may decrease inflammatory cytokine secretion.
［Key words］ Xilei oral sustained-release mucoadhesive films;recurrent aphthous ulcer;tumor necrosis factor-alpha;interleukin-1
复发性阿弗他溃疡（recurrent aphthous ulcer，RAU），又称复发性口腔溃疡，是一种具疼痛症状、周期性复发的口腔溃疡性疾病，其发病原因不详，致病机制不明确，是多因素综合作用的结果，由于口腔特殊的生理环境，传统的口腔黏膜给药剂型（如散剂、涂剂、含片、含漱液、咀嚼片等）虽能快速起效，但由于易受唾液冲洗、人不自觉的吞咽动作而导致药物滞留时间较短，且药物浓度随着持续的唾液分泌而下降，从而难以达到持续有效的药物浓度，造成疗效下降。为充分发挥药效，我们利用现代药学新技术药物缓释技术和生物黏附技术制成了生物黏附贴膜锡类散缓释贴膜，通过局部外用对RAU家兔动物模型进行治疗观察。
1 对象与方法
1.1 研究对象 取家兔24只，由实验动物中心提供，所有大鼠同室分笼饲养，自然光照，自由饮水进食。兔TNF-α、IL-1、ELISA试剂盒上海蓝基生物科技有限公司。锡类散缓释贴膜自备。
1.2 RAU动物模型制备
1.2.1 抗原乳化液制备 取2只家兔，急性处死后剥取口腔黏膜组织，用内切式匀浆器匀浆，超声波震荡，低温离心，保留沉淀物，取上清液再行透析以滤过小分子物质，将大分子蛋白留于袋内。透析过程反复5次，将袋内物冷冻干燥，获得粉末状蛋白。
1.2.2 动物模型制备 将提取的口腔黏膜蛋白12.5 mg溶于0.5 ml磷酸缓冲液中，再加入0.5 ml的完全弗氏佐剂呈乳化液，注入家兔脊柱两侧皮内，共注射20点，每隔2周注射1次，共注射5次。
1.3 实验分组及给药 取家兔9只，随机分成三组，一组空白模型组，不给药；一组为模型贴膜组，固定家兔口腔，将贴膜敷之上；一组为模型散剂组，1日1次，固定家兔口腔，将散剂吹撒溃疡面上，每4 h 1次，1日3次。用药后固定2 h。
1.4 检测项目与方法 溃疡组织TNF-α、IL-1测定：将组织标本剪切成1 mm3的小块，按1块/cm2的密度种植于培养瓶内，30 min后置入RPMI1640完全培养液，37 ℃培养，24 h后采集组织标本上清液，-70 ℃保存，待测。采用双抗体夹心ELISA法检测，严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.5 统计学处理 所有的数据均以均数±标准差（x±s）表示，经SPSS 11.5处理，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实验动物数量分析 纳入家兔24只，均进入结果分析，无脱失。
2.2 组织培养液上清TNF-α测定 与空白模型组相比，模型贴膜组TNF-α明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）。模型散剂组浓度较空白模型组低，差异有统计学意义（P<0.01）。而模型贴膜组与模型散剂组相比较，模型贴膜组TNF-α较低，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。 表1 各组血清中TNF-α及IL-1 的变化
2.3 组织培养液上清IL-1测定 与空白模型组相比，模型贴膜组IL-1明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）。模型散剂组浓度较空白模型组低，差异有统计学意义（P<0.01）。而模型贴膜组与模型散剂组相比较，差异有显著性（P<0.01），见表1。
3 讨论
“锡类散”出自《金匮翼》，收载于《部颁标准》中药第2册，主要成分:牛黄、青黛、冰片、珍珠、象牙屑、人指甲、壁钱炭等。功能:解毒化腐，用于咽喉糜烂肿痛。据文献报道［1，2］，锡类散具有抑制多种溃疡动物模型黏膜血流减少的作用。本实验造模方法与RAU的临床表现、病理、免疫指标基本相同。引起实验家兔发生溃疡的机制可能是特异性蛋白作为抗原进入机体后，产生了特异性抗体而引发口腔黏膜的免疫反应。近年来，不少学者对RAU的病因学进行系统研究，试图明确致病因素以根治此病。目前国内外学者比较一致的看法是：免疫、遗传和环境可能是RAU发病的“三联因素”，即遗传背景与适当的环境因素（包括精神神经体质、心理行为状态、生活工作和社会环境等）相遇，引发异常的免疫反应而出现RAU特征性病损［3］，而介导异常免疫反应的主要细胞因子多为肿瘤坏死因子（如TNF-α、TNF-β）、白细胞介素-2（IL-2）等［4］。肿瘤坏死因子（TNF）是一类具有多种生物效应的细胞因子，根据其基因结构和细胞来源，可分为TNF-α和TNF-β两类，TNF-α主要由单核巨噬细胞分泌，TNF-β主要由活化T细胞产生。它们通过和细胞膜上的特异性的受体结合，实现促进细胞生长、分化、凋亡及诱发炎症等生物学效应［5，6］。RAU病变组织中TNF-α呈现高表达，其mRNA在RAU患者的病变黏膜中含量水平显著上升［7］。有试验显示［8］，抑制内源性TNF-α可减轻RAU的发生［9］，提示TNF在RAU致病机制中可能占有一定地位。IL-1为致炎性细胞因子之一，具有多种生物学效应，能通过自分泌或旁分泌刺激其他细胞因子和炎症介质IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α等的产生，并相互影响。可促进B细胞的增殖、分化、介导免疫球蛋白的分泌，激活补体，杀伤细胞及吞噬细胞的活性，增强细胞免疫和体液免疫介导组织损伤。此外，IL-1可产生对中性粒细胞等炎症细胞的趋化作用。表明IL-1在RAU致病机制中同样也占有一定地位。因此，抑制TNF-α、IL-1的合成、分泌，就能有效地抑制局部炎症反应。实验显示空白模型组组织培养液上清TNF-α、IL-1的水平，与模型贴膜组和模型散剂组相比较均高，经参芪扶正注射液治疗后，该炎症组织表达的TNF-α明显减少。因此，给予锡类散治疗，能明显减轻病情，减少TNF-α等炎症细胞因子的分泌，减轻上皮细胞的损伤，保护黏膜屏障。对RAU动物模型有效，对人类RAU患者是否有效，还需对人体病变组织的作用和大样本随机对照临床观察。同时本研究还显示模型贴膜组和模型散剂组TNF-α、 IL-1的表达差异有统计学意义（P<0.01），对于这一结果目前只是一个初步研究，其原因可能是缓释贴膜在药效维持的时间上较散剂维持时间长，为明确其原因尚需进一步研究。
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（本文编辑：丁 平）
作者单位：江西省卫生厅中医药科研基金课题（编号：2006B38） 344000 江西抚州，江西中医药高等专科学校