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The relationship of the expression of p53and VEGF in
rectal carcinoma tissue microarray
Zhou Chengying，Zhao Haiou，Yan Bizhong，et al.
Yancheng First People’s Hospital，JiangSu224001.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the expression of p53and VEGF in rectal carˉcinoma tissue microarray.Methods The expressionsof p53and VEGF were investigated with the immuno-histoˉchemistrystudy.ResultsThe expression rates of VEGF，p53were64.4%（58/90），48.9%（44/90），respectively.Comparative study of the series sections revealed that in the areas with higher VEGF expression there were more intenˉsive p53expressions.But X 2 test showedthat VEGF expression was correlated only with p53（X 2 =5.65，P<0.05）.Conclusion VEGF expression was correlated significantly with the expression p53.
Key words VEGF p53 tissue microarray immunohistochemistry rectal carcinoma
为了研究直肠癌组织芯片中血管内皮生长因子（VEGF）的表达与p53之间的关系，我们采用了免疫组化染色的方法对直肠癌组织芯片中的血管生成与VEGF表达、p53突变间关系进行探讨。
1 材料和方法
1.1 材料来源 收集2001年10月间盐城市第一人民医院外科手术切除的直肠癌标本90例，直肠癌分类按照WHO标准分类 ［1］ 。复习所有临床资料，并对患者进行随访。肿瘤标本均经中性福尔马林液固定，常规石蜡包埋，由陕西超英生物医学研究开发公司制成直肠癌组织芯片。第一抗体:血管内皮生长因子（VEGF），p53。第一抗体及S-P试剂盒及DAB均购自于福州迈新生物技术开发公司。所有90例直肠癌组织芯片切5μm厚蜡片备用。免疫组织化学染色程序:蜡片常规脱蜡至水;医用微波炉抗原修复:缓冲液10min，3%双氧水10min;水洗2min3次;滴加一抗（鼠抗人p53;VEGF），4℃过夜;滴加生物素化的山羊抗小鼠IgG和S-P复合物，37℃各20min，0.01mol/L PBS洗5min3次;DAB显色;流水冲洗;脱水、透明、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.2 显微镜下结果判定 对免疫组化标记后的病理切片，于相同强度光线下用低倍镜或高倍镜依次观察表皮、表皮下结缔组织中分布情况。“阳性细胞”为细胞核内出现棕黄色颗粒（见图1～3）。在高倍镜下随机选取5～10个视野，以“-”表示无阳性细胞、“-/+”表示见少数可疑阳性细胞、“+”表示阳性细胞数小于25%、“++”表示阳性细胞数25%～50%、“+++”表示阳性细胞51%～75%、“++++”表示阳性细胞大于75%，p53为核阳性，VEGF为细胞浆阳性。应用X 2 检验，P<0.05为差异有显著性，进行半定量分析。
1.3 统计学处理 每组标本均数间的比较用t检验进行统计学处理。
2 结果
见表1。表1 p53表达率与VEGF的关系(略）
3 讨论
3.1 结果分析 p53蛋白参与细胞周期的控制、DNA修复和细胞凋亡。p53基因分为野生型和突变型。野生型p53是抑癌基因，因其半衰期短，不易被检测出来。而突变型p53为癌基因，具有致癌活性，能直接激活PCNA基因的启动子，促进细胞的增殖与转化，导致肿瘤发生癌变。突变型p53不仅稳定性增加，半衰期延长，并于核内积聚，免疫组化易于检测到。研究表明，用免疫组化方法检测到阳性表达的p53为突变型p53蛋白。
VEGF是一种特异性促使血管内皮细胞增殖的有丝分裂原，在肿瘤的生长与转移中起重要作用。它通过与两种选择性表达在血管内皮细胞上的高亲和力酪氨酸受体（flt-1和KDR/flk-1）的结合来发挥作用。研究表明，在直肠癌中VEGF表达明显增高，VEGF表达与肿瘤转移及肿瘤血管密度密切相关，并可作为判断预后的指标。阻断VEGF表达可达到抑制肿瘤生长及转移的目的。本实验就采用了以检测p53突变蛋白的方式来评价p53基因突变与VEGF表达之间的关系。Folkman ［2］ 认为肿瘤的发生是一个多步骤的过程，而血管生成是肿瘤发展的限速步骤，在肿瘤进展中血管生成这一表型可能是原癌基因激活和抑癌基因失活的结果，这一点在Olga的实验中得到了证实:p53突变和Ras激活使VEGF的表达量升高，而血管生成抑制因子TSP则显著下降，说明p53突变在肿瘤血管生成开关中起到了重要作用 ［3］ 。
本研究发现，VEGF的表达率为64.4%（58/90），p53的表达率为48.9%（44/90）。经连续切片对比分析表明，在VEGF表达较高的区域，p53的表达亦较强，X 2 检验发现p53突变与VEGF表达相关。无论从切片对比分析p53和VEGF蛋白表达的部位还是从统计学的分析中，都可以看出p53突变与VEGF的表达显著相关。即当野生型p53发生突变后就失去了抑制VEGF转录及表达的功能，导致肿瘤血管的新生，这与目前大多数的研究结果相符 ［4，5］ 。迄今为止，未见关于直肠癌组织芯片中的血管生成与VEGF表达、p53突变间关系的报道，我们的研究表明，p53可能起更重要的作用，针对p53突变的基因治疗，不仅可以从其致癌性方面加以治疗，还可以运用组织芯片大样本的回顾性研究，这对直肠癌的基因治疗具有重要意义。
3.2 组织芯片技术的基本原理 组织芯片又称组织微阵列（tissue microarray），1998年由Kononen等 ［1］ 在cDNA微阵列的基础上发明的一种特殊的生物芯片，是20世纪90年代末期才刚刚兴起的高科技生物技术，它是将数十个甚至数千个不同个体的组织标本集成在一张固相载体上所形成的组织微阵列生物芯片，简称组织芯片，是DNA芯片技术的发展和延伸。组织芯片为医学分子生物学特别是分子流行病学提供了一种高通量、大样本以及快速的分子水平的分析工具。它克服了传统病理学方法和DNA芯片技术中存在的某些缺陷，使人类第一次有可能利用成百上千份自然或处于疾病状态下的组织标本，同时研究某一个特定基因和基因所表达的相应产物，这对人类后基因组学的深入研究与发展，特别是对研究特定基因及其所表达的蛋白质与疾病之间的相关关系，疾病的分子诊断、预后指标的确定、治疗靶点的定位、治疗效果的预测、抗体和药物的筛选以及基因治疗的研发等方面均有着十分重大的实用价值。组织芯片技术可以广泛地与DNA、RNA、蛋白质、抗原、抗体、细胞、微生物、传统的病理学技术、组织化学、免疫组织化学、原位杂交、原位PCR、原位RT-PCR、原位DNA合成等技术相结合，分别在基因、转录和表达产物的生物学功能这3个水平上进行研究。组织芯片技术的广泛应用将会极大地促进现代医药学、基因组学和后基因组学研究的深入发展，并有可能出现人类医学研究史上的重大突破。
3.3 组织芯片产品的特点 基因芯片和蛋白芯片是研究同一种细胞中成千上万个基因或蛋白分子变化的情况，而组织芯片则是研究同一种基因或蛋白分子在成千上万种细 胞或组织中表达的情况。所以，组织芯片技术不但是传统病理学技术的进一步发展，也是基因芯片和蛋白芯片的进一步延伸。组织芯片技术具有如下优点:（1）高通量:一次检测可获取大量的生物学信息;（2）大样本:一次实验可分析成百上千种同一或不同疾病的组织标本;（3）省时快速:1～2周之内可完成数千个组织标本的数十个基因表达或蛋白分子的定位、定量、定性分析;（4）简便经济:是传统病理学方法所需费用的1/10～1/100;（5）用途广泛:即可用于基础研究，也可用于临床研究。可用于分子诊断，预后指标筛选、治疗靶点定位、抗体和药物筛选、基因和蛋白表达分析等等;（6）结果可靠:一次实验即可完成数千个组织标本的分析，故无批内和批间误差，实验结果更为准确可靠;（7）便于设计实验对照;（8）可进行自动化分析:用特殊的扫描和分析仪器即可对组织芯片进行自动化分析;（9）与其他生物技术如蛋白芯片相结合，即可组成免疫组化细胞表型检测分析系统;与基因芯片相结合，即可组成完整的基因表达分析系统。
3.4 组织芯片产品的应用领域 组织芯片技术和其产品的应用市场，实际上涵括了整个生命科学中各个基础研究、临床研究、应用研究以及药物开发的相关领域。用组织芯片技术可以进行常规病理学的HE染色、各种免疫组织化学染色、原位杂交、荧光原位杂交、原位PCR、原位RT-PCR和寡核苷酸启动的原位DNA合成（PRINS）等