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【摘要】 目的 探讨定量HBV-DNA与HBV其他标志物(HBVM)及乙肝前S1蛋白(Pre-S1)检测间的关系，正确评价其临床意义。方法 采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)对360例血清HBVM阳性患者进行HBV-DNA检测，并且还对其中162例HBsAg、HBeAg、HBcAb（即1.3.5）阳性和HBsAg、HBeAb、HBcAb（即1.4.5）阳性及HBsAg、HBcAb（即1.5）阳性三种乙肝感染模式的患者进行Pre-S1同步检测。结果 对1.3.5和1.5两种乙肝感染模式应用FQ-PCR检测HBV-DNA与进行Pre-S1检测，差异无显著性（P＞0.05），但前者阳性率(96.92%、63.63%)高于后者(94.00%、50.00%)；而在1.4.5感染模式中HBV-DNA与Pre-S1检测结果比较，差异有显著性（P＜0.05）。结论 实时荧光定量PCR技术所检测的HBV-DNA是目前临床诊断乙肝感染与复制及观察疗效的可靠指标。
【关键词】 FQ-PCR；Pre-S1；乙型肝炎；HBV-DNA
乙型肝炎（HBV）是威胁我国人民健康最重要的传染病之一。自1965年Blumberg发现HBsAg以后，HBV的研究就揭开了序幕。1983年由美国Cetus公司Kary B Mullis发明了聚合酶链反应（PCR）技术，短短几年，PCR就以其灵敏度高、特异性强的特点，广泛应用于HBV感染的研究和诊断。1995年美国PE公司又对实时荧光定量PCR（FQ-PCR）技术研制成功。由于这种技术具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，且定量动态范围高达十个数量级。因此，近年来，FQ-PCR对HBV的研究又重新拉开了帷幕，研究正在向纵深发展。本文也采用FQ-PCR对江西萍乡地区360例乙型肝炎患者进行了HBV-DNA检测分析，并就FQ-PCR在乙肝检测方面的临床价值作一探讨。
1 资料与方法
1.1 检测对象 360例肝炎患者均为我院传染科住院和门诊病人，年龄6～72岁，平均31岁。临床诊断符合1995年病毒性肝炎防治方案标准［1］。空腹取患者3ml血液，分离血清置-20℃冰箱备用。
1.2 检测方法
1.2.1 主要试剂 FQ-PCR试剂盒由上海复星公司提供，探针序列在S基因区，上游引物5′-CTCGGATCCTTGTGACTTCTTTCCTG-3′；下游引物5′-CGGAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCT-3′；乙肝病毒标志物（HBVM）五项试剂盒由上海科华生物技术有限公司提供；Pre-S1试剂由中科院上海生化所提供。
1.2.2 SLAN荧光定量PCR检测系统 由上海宏石医疗科技有限公司生产；SM-3酶免仪、DEM-Ⅲ酶标洗板机由北京航宇浪琴医疗设备有限公司生产。
1.2.3 FQ-PCR工作原理 利用Taq酶的5′→3外切酶活性在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5′端标以荧光发射基团FAM，靠近3′端标以荧光淬灭基团TAMRA，探针的3′端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除。518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动到探针切断，淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。
1.2.4 统计学处理 采用χ2检验。
2 结果
360例3种感染模式（1.3.5；1.4.5；1.5）的患者血清标本经FQ-PCR检测HBV-DNA的阳性（指：检出浓度>1.0×103为阳性，<1.0×103为阴性）率分别为96.92%、16.88%、63.63%；同步检测Pre-S1的阳性率分别为94.01%、33.85%、50.00%（见表1）。
表1 血清HBV-DNA与HBVM及Pre-S1检测结果比较（略）
3 讨论
FQ-PCR是在常规PCR基础上加荧光标记探针来实现其定量功能的，其特异性强、灵敏度高，并采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确，同时仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断。而过去常规PCR如电泳法和反向膜杂交法只是对扩增产物采用终点法分析，无法实现定量检测，且阳性率较前者低。本文资料显示，应用FQ-PCR检测萍乡地区乙肝1.3.5组和1.5组HBV-DNA阳性率(96.92%、63.63%)明显高于1998年江西萍乡巫小萍等［2］反相膜杂交法（定性）检测HBV-DNA阳性率（89.50%、39.10%），可见FQ-PCR其灵敏度高是显而易见的，它将替代以前常规PCR。
表1中乙肝1.3.5组和1.5组HBV-DNA阳性检出率与Pre-S1阳性检出率无明显差异，(χ21.3.5=0.49，P＞0.05；χ21.5=0.01，P＞0.05)，结果提示，HBV-DNA与HBV基因前S1区编码的产物即Pre-S1两者相关极为密切，但前者的阳性率高于后者这一事实，又说明Pre-S1不能替代HBV-DNA的检测，而且，FQ-PCR HBV-DNA仍然是目前检测乙肝的最可靠的依据。
附表中乙肝1.4.5组HBV-DNA阳性检出率只占16.88%，明显低于天津孙秀凤等(64.7%)［3］的文献报道(χ2=49.97，P＜0.01)，但与1998年江西萍乡巫小萍等(19.3%)［2］的文献报道一致(χ2=0.17，P＞0.05)。这一现象提醒我们：对萍乡地区乙肝1.4.5感染模式HBV-DNA检出率如此低的原因，还很有必要在今后的工作中再做深入的分析研究。
表1中乙肝1.4.5组HBV-DNA阳性检出率(16.88%)与Pre-S1阳性检出率(33.85%)，差异有显著性(χ2=5.89，P＜0.05)。结果提示：Pre-S1作为HBV前S1区编码的蛋白分子，有它自身的半衰期，不同亚型的HBV所产生的Pre-S1会不同，其半衰期的时间也会各不一样，所以本文认为，以前把Pre-S1作为一种反映病毒复制情况的标志与HBV-DNA的作用等同起来还值得商榷。
【参考文献】
1 病毒性肝炎防治方案(试行).中华传染病杂志，1995，13：241.
2 巫小萍.PCR杂交流法对HBsAg阳性药品从业人员的检测结果探讨.江西医学检验，1998，16（3）：135-136.
3 孙秀凤.乙型肝炎病毒前S1蛋白与乙肝E系统及HBV之间的关系探讨.江西医学检验，2005，23（1）：49-50.
(编辑：若 木)
作者单位： 337000 江西萍乡，萍乡市第二人民医院