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【摘要】 建立胆宁片中盐酸小檗碱含量的HPLC测定方法。采用C18色谱柱，以乙腈-0.033mol/L磷酸二氢钾溶液(40：60)为流动相，流速为1.0ml/min，柱温20℃，检测波长为345nm。盐酸小檗碱在0.044～0.440μg范围内呈良好线性，回归方程Y=4569X-3731.09,r=0.9999，平均回收率为100.8%，RSD=1.1%(n=5)。本法简便，快速，结果准确。
【关键词】 HPLC;胆宁片;盐酸小檗碱;含量测定
【Abstract】 A HPLC method for the determination of berberine hydrochloride in Danning Tablets was established. A C18 Column was used，with the mobile phase of acetonitrile-0.033 mol/L potassium phosphate monobasic acid(40∶60). The flow rate was 1.0ml/min,the column temprature was 20℃,and the detection wavelength was 345 nm. The calibration curve was linear at a range of 0.044～0.440μg for the berberine hydro-chloride and linear equation was Y=4569X-3731.09,r=0.9999. The average recovery was 100.8% and the relative standard deviation(RSD)was 1.1%(n=5). The method was simple, fast and accurate.
【Key words】 HPLC; Danning Tablets; berberine hydrochloride; determination
胆宁片由人工牛黄、水飞蓟素、盐酸小檗碱、延胡索、大黄、蒲公英、金钱草、薄荷油等药物组成，可用于治疗慢性胆囊炎，胆道感染及胆结石。现行药品标准中无含量测定项，不利于控制药品质量[1]。本文建立HPLC法测定其中盐酸小檗碱的含量，方法简便，快速，结果准确，为胆宁片中盐酸小檗碱的定量分析提供了科学有效的方法。
1 仪器与试药
Agilent 1100 Series高效液相色谱仪(单元泵G1310A， VWD检测器G1314A，7725i进样阀G1328B，20μl定量环，Agilent Chemstation revi-sion B.02.01-SR1[260]);TU-1901紫外可见分光光度计;乙腈(美国天地试剂公司);重蒸馏水;其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱Lichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm);柱温20℃;流动相为乙腈-0.033mol/L磷酸二氢钾溶液(40：60);流速为1.0ml/min;检测波长345nm;进样量为20μl。
2.2 对照品贮备液的制备 精密称取经减压干燥光度计;盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110713-200008，供含量测定用);胆宁片市售品为陕西某制药企业产品3批(批号:20040501，20050801，20050926);乙腈[色谱纯(真空度0.075MPa,温度20℃，干燥剂五氧化二磷)]24h的盐酸小檗碱对照品适量，置50ml量瓶中，加入盐酸-甲醇(1：100)混合溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含盐酸小檗碱为0.11mg)。
2.2 对照品贮备液的制备 精密称取经减压干燥光度计;盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110713-200008，供含量测定用);胆宁片市售品为陕西某制药企业产品3批(批号:20040501，20050801，20050926);乙腈[色谱纯(真空度0.075MPa,温度20℃，干燥剂五氧化二磷)]24h的盐酸小檗碱对照品适量，置50ml量瓶中，加入盐酸-甲醇(1：100)混合溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含盐酸小檗碱为0.11mg)。
2.3 供试品溶液的制备 取本品20片，除去糖衣，精密称定。研细，精密称取适量(约相当于盐酸小檗碱1.25mg)，置25ml量瓶中，加盐酸-甲醇(1:100)混合溶液15ml，超声处理(功率80W，频率50kHz)30min，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。
2.4 阴性对照样品溶液的制备 按胆宁片处方配比及工艺制备不含盐酸小檗碱的阴性样品，照供试品溶液制备项下方法制备，即得。
2.5 方法的专属性 在拟定的色谱条件下测定，结果表明，对照品峰、供试品相应峰与阴性样品峰无重叠，盐酸小檗碱峰与其他相邻峰能较好地分离，出峰时间适中，峰形极佳;理论板数以盐酸小檗碱峰计算为3000，盐酸小檗碱峰保留时间约为6.7min，其他成分及辅料不干扰测定。色谱图见图1。
2.6 线性关系考察 精密量取对照品贮备液1.0，3.0，5.0，7.0，10.0ml分别置50ml量瓶中，再分别用流动相稀释至刻度，摇匀，制成一系列浓度的对照品溶液，精密吸取上述各溶液20μl，按上述色谱条件进行测定，以盐酸小檗碱的量(X:μg)为横坐标与相应的峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=4569X-3731.09，相关系r=0.9999，盐酸小檗碱在0.044～0.440μg。
2.7 稳定性试验 精密量取同一批号的胆宁片供试品溶液，分别在0、0.5、1、2、4、24h时测定。结果其峰面积基本不变，RSD为0.51%，表明供试品溶液在24h内基本稳定。
2.8 精密度试验 取同一批号的胆宁片供试品细粉适量，精密称定，制备供试品溶液，精密量取20μl，注入液谱仪，连续进样5次，结果RSD为0.81%，表明仪器精密度良好。
2.9 重现性试验 取同一批号的胆宁片供试品细粉适量，精密称取5份，分别制备供试品溶液，精密量取20μl，注入液相色谱仪。结果平均含量为12.36mg/片，RSD为1.2%。
2.10 加样回收率试验 精密称定批号为20040501样品细粉6份，各精密加入盐酸小檗碱对照品溶液(浓度为0.11mg/ml) 1ml，按2.3制备待测溶液，按2.1测定，结果平均回收率及RSD分别为100.8%，1.1%。
2.11 样品测定 按2.2制备对照品溶液及3批胆宁片的供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，照2.1测定3批胆宁片中盐酸小檗碱含量。外标法计算，测定结果见表1。表1 样品含量测定结果(n=5)
3 讨论
3.1 测定波长的选择 参考文献[2]，所采用的测定波长为265nm;而本品由八味中药材或单体组成，组分复杂，在265nm的波长处检测干扰较大。经对盐酸小檗碱对照品的甲醇溶液在200～400nm的波长范围内进行扫描，结果在345nm处具有最大吸收，故选择345nm作为检测波长。
3.2 提取方法的选择 参考文献[3]，以含1%盐酸的甲醇溶液进行提取有利于盐酸小檗碱的溶出完全，并可显著减少其他杂质峰的干扰。曾考察样品超声处理时间，结果表明30min可提取较为完全。
3.3 流动相的选择 参考文献[2]，分别采用乙腈-0.033mol/L磷酸二氢钾溶液(60：40;50：50;40：60)为流动相，进行试验，结果以乙腈-0.033mol/L磷酸二氢钾溶液(40：60)为流动相所得色谱图分离效果及出峰时间较为合适。因此选择流动相为乙腈-0.033mol/L磷酸二氢钾溶液(40：60)。
【参考文献】
1 卫生部药品标准.中药成方制剂(第十二册),1997，136.
2 国家药典委员会.中国药典(二部).北京：化学工业出版社，2005，534-535.
3 国家药品监督管理局国家中成药标准汇编.内科·肾系分册,2002，75-78.