基因工程药物的现代仪器分析法

随着分子生物学的发展，出现了许多基于重组DNA技术的特效药物，如治疗肾性贫血的基因工程人红细胞生成素(rHuEPO)，治疗白细胞缺乏的基因工程人粒细胞集落刺激因子(rHuG-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rHuGM-CSF)，这些药物与传统的化学合成药物不同，其结构复杂，生产难度大，很难或无法采用分析小分子化学药物的手段表征其纯度、含量和结构。美国FDA在审批这些药品时，严格控制其生产过程和生产地点。如果能建立一套仪器分析方法，像表征小分子合成药物那样简便，则可使基因工程药物的开发时间缩短，生产成本降低。 目前国内外的生物技术工作者，将大量的精力都集中在基因工程产品的上游研究，而对质量控制的研究相对较少。如何用仪器分析方法与动物体内生物学活性测定法相结合，有效地控制基因工程产品的质量，是目前国内外分析界和生物技术界研究的热点之一。 1　基因工程药物的特点 基因工程药物是通过对核酸分子的插入、拼接和重组而实现遗传物质的重新组合，再借助病毒、细菌、质粒或其他载体，将目的基因转移到新的宿主细胞系统，并使目的基因在新的宿主细胞系统内进行复制和表达的技术。最先应用基因工程技术的产业领域就是制药工业。基因工程技术在制药工业中的应用主要有重组蛋白质类药物、疫苗及单克隆抗体等的生产。与化学合成法、组织提取法或传统的发酵法相比，生产成本低。目前以DNA重组技术为基础的生物技术成果主要集中在蛋白质类、多肽类基因工程药物和基因工程疫苗。多肽和蛋白质通常是由20种α-氨基酸通过肽键联成的长链分子，有些还含有非肽链结构的其他组成成分，如糖蛋白等。蛋白质分子很大，组成其氨基酸的数目常在100个以上，有些甚至达上千个，其结构十分复杂。 蛋白质的分子结构有不同的层次，通常有一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。蛋白质的高级结构是由其一级结构所决定，所以一级结构是蛋白质分子结构的基础，正确表征显得尤其重要。表征蛋白质一级结构的内容有含量、纯度、等电点、分子量、肽谱、氨基酸序列和N-端序列等。高级结构的质量控制难度较大，仍在探索研究中，目前主要是通过其一级结构的质控来实现。 与一般药品相比，除具有复杂的分子结构外，基因工程药物还有一大特点就是它来源于活的生物体(细菌或细胞)，它的生产涉及到生物材料和生物学过程，如发酵、细胞培养、分离纯化目的产物等，这些过程有其固有的易变性，因此必须对原材料、培养过程、纯化工艺过程、最终产品进行全面的质量控制。 由于基因工程药物分子的这些特殊性，目前经常采用的方法主要有生物学技术和传统的生化分析技术，如细胞株依赖法、凝胶电泳法和紫外光谱法等。用于基因工程产品质量研究的现代仪器分析法主要有质谱(MS)、高效毛细管电泳(HPCE)、高效液相色谱(HPLC)、CE-MS和LC-MS联用技术等，其中MS法有电喷雾质谱和基体辅助激光解吸飞行时间质谱法。在基因工程产品研究和生产中，用仪器法可以解决以下几个重要问题：(1)产物在表达和纯化后的纯度如何?(2)表达产物的一级结构是否正确?(3)蛋白质是否经过后修饰?(4)不同表达载体、不同批次的产品质量稳定性如何?(5)生产条件的更改及优化对最终产品质量的影响如何?(6)制剂中微量活性成分的质量如何?(7)糖蛋白的微观不均一性如何?(8)如何判断假劣药品等。 2　毛细管电泳法在基因工程药物质量研究中的应用 2.1　毛细管电泳法及其特点 电泳分离是依据电场中溶质的不同迁移速率，毛细管电泳(CE)是在毛细管中进行的电泳分离。 CE是电泳的分离机理与色谱的仪器自动化相结合的产物，尤其适用于离子型物质的分析。蛋白质类生物大分子在等电点以外的环境中均带有净电荷，不同的蛋白质其分子大小、荷电情况不同，由CE分离得到的图谱可反映蛋白质的分子结构信息；传统表征蛋白质的许多方法都是基于凝胶电泳，如SDS-PAGE、IEF等，与CE具有很大的相似性，故有丰富的经验可供借鉴；另外，CE所需样品量少，选择性好，易与其它高灵敏度的检验器相结合。 CE的应用范围很广，其中应用最多的首推肽和蛋白质，这也是CE发展的初衷。 2.2　在鉴别研究中的应用 CE在蛋白质和肽鉴别分析中应用最多的是CZE测定肽谱、SDS-CGE测定蛋白质分子量及CIEF测定蛋白质的等电点等。 肽谱是鉴别蛋白质一级结构的指纹图谱，利用CE的高分辨率，可以分离得到更为特征的肽谱。常用的消化试剂有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、溴化氰、Arg-C和Glu-C等。常用的检测手段有紫外吸收法、激光诱导荧光法及质谱法等。Frenz等［1］通过对重组人生长激素(rHuGH)的HPLC和CE肽谱比较后，认为两者可互作补充，并且CE可提供更多的蛋白质一级结构的信息，测定快速。Apffel等［2］采用HPLC和CE测定了单链纤溶酶原激活因子(DSPAαl)的Arg-C酶解肽谱，并且用CE进一步分离了HPLC的馏分，结果表明CE的分辨率高，可用于结构相近的糖肽的分析。Mazzeo等［3］提出用电渗流趋动的毛细管等电聚焦测定肽图的方法。作者用CE、CE-ESI-MS和HPLC法测定了rHuEPO的肽图，确证了70%以上的胰酶消解片段，对糖肽结构、二硫键及结合位置也进行了详细研究［4］。Rush等［5］报道了用亲和毛细管电泳测定rHuEPO肽图的方法。 由于基因工程药物肽图测定的重要性，所以用于肽图测定的方法学本身发展也很快。Amankwa等［6］首先提出将胰酶固化在毛细管壁用于在线消化微量蛋白的方法，即蛋白质在经酶修饰的毛细管中完成酶解过程，于室温环境下，25 min内足可使蛋白质完全消化，仅14 fmol的消化物通过在线偶合装置流入另一根石英毛细管进行电泳分离，借助于这套装置便可在3 h以内完成pmol级蛋白样品的在线肽谱分析。采用激光诱导荧光可选择性地检测含色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的肽片段［7］。Bonneil等［8］提出用胰酶固化在多孔玻璃(CPG)上形成微反应器，可达到快速测定肽图的目的。Bossi等［9］提出了一种采用亚氨基二乙酸为等电点缓冲液进行肽谱分析的方法，与常规肽图分析法相比，具有极高的分辨率并且迁移时间缩短一半。Beale等［10］发展了肽图测定的毛细管凝胶梯度法。也有用毛细管电泳收集消化肽碎片后进行氨基酸组成分析的报道。CE-MS是肽谱分析的重要工具，可用于确证肽谱中各峰的归属，作者在该领域作过专门研究［4，11，12］。分子量可用于鉴别蛋白质，Tsuij等［13］用SDS-CGE法监测浓缩重组牛生长激素过程中单聚体及二、三、四多聚体的量。 2.3　在纯度和含量测定中的应用　 在蛋白质测序前，通常必须采用CE法监测HPLC流出组分的纯度。用疏水柱分离时，如蛋白质的疏水性相近，则在HPLC中往往出现单峰。Grossman等［13］采用CE检测RP-HPLC纯度为99.2%的肽时，发现样品中含有6个组分，主峰的纯度仅为50%。Wiktoratixz等［14］讨论了各种纯度检测，并提出了纯度检测的最有效策略。目前CE已成功地用于基因工程产品的纯度检测。Yowell等［15］采用CZE，CIEF和HPLC法测定了制剂中rHuGM-CSF的含量和纯度，并讨论了制剂中基体对测定的影响。在重组人肿瘤坏死因子(rHuTNF)，白细胞介素-2(rHuIL-2)和γ干扰素(rHuIFN-γ)等基因工程药物测定中的应用也有报道［16］。Bietlot等［17］用CE定量分析rHuEPO注射液中的微量主药。林炳承等［18］采用CE改性柱分析了重组人体生长因子和rHuTNF的纯度。Park等［19］采用CE法定量测定了以白蛋白(HSA)为基体的rHuIFNα1注射液中的微量rHuIFN-α1，检测限为1 μg.mL-1，即0.25fmol。作者用CE法测定了rHuG-CSF、rHuGM-CSF、rHuIL-2等生物制剂中主药的含量，并对制剂中微量杂质的测定作了详细研究［20］。 2.4　在微观不均一性测定中的应用　 许多天然蛋白质和用真核细胞(如CHO和BHK)表达的重组DNA产品，往往不是由单一结构所组成。在糖蛋白中，糖基的微观不均一性的改变就可能使糖蛋白本身的生理活性发生改变，所以有必要采用选择性强的方法表征糖的微观不均一性。目前用于微观不均一性研究的CE手段主要有CZE、CIEF和MEKC 3种模式。用CIEF和CZE法分析糖链末端唾液酸化的产物较好，如有很多报道采用CIEF和CZE法分析重组人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(rtPA)和rHuEPO中含唾液酸糖的微观不均一性［21，22］。James等［23］用MEKC法分离了rHuIFN-γ的微观不均一性。作者用CE法分离了rHuEPO中的7个组分［24］。 3　电喷雾质谱法的应用 3.1　方法原理 以电喷雾离子源的质谱技术称为电喷雾质谱法，电喷雾的过程如下： 第一步：喷雾器顶端施加一个电场给微滴提供净电荷；第二步：在高电场下，液滴表面产生高的电应力，使表面被破坏产生微滴；第三步：荷电微滴中溶剂的蒸发；第四步：微滴表面的离子“蒸发”到气相中，进入质谱仪。为了降低微滴的表面能，加温可使喷雾效率提高。 3.2　准确分子量的测定 ESI/MS是生物大分子精确分子量测定的重要工具，在发现和阐述新蛋白结构修饰方面起到核心作用［25，26］。通过ESI/MS提供的分子量信息，可以确证蛋白质氨基酸序列是否正确，并由此推断DNA序列是否正确。已有报道用ESI/MS测定rHuIL-2，rHuIL-1α、rHuGH和rHuIFN-1α等基因工程药品的准确分子量［27］。作者采用ESI/MS法研究了rHuG-CSF的分子量和纯度［20］。 Gross等［28］将ESI/MS和H/D同位素交换法相结合鉴定了用于糖尿病治疗的4种不同胰岛素药物：猪胰岛素、牛胰岛素、重组人胰岛素及其类似物，它们的理论分子量分别为5778、5734、5808和5808，2种重组产物是同分异构体，无法根据分子量鉴别，但经过60min H/D交换反应后，由于空间结构的差异，4种胰岛素的质量分别增加了28、25、30和38，据此可对未知样品进行鉴别。 ESI/MS分析生物大分子的缺点是仅能得到多电荷离子峰，不能了解分子的碎片信息，通过对多电荷离子的串联质谱(MS/MS)分析，可以确定氨基酸的序列，目前已有报道用CID法分析不同来源的细胞色素C［29］。采用CID法分析蛋白质的氨基酸序列是发展方向。 3.3　微观不均一性测定　 Rush等［30］采用ESI/MS研究了rHuEPO糖基结构的微观不均一性，鉴定了52种N-连接糖的形式；Tsarbopoulos等［31］采用LC-ESI-MS法分析了由CHO细胞表达的rHuIL-4；Affel等［3］用选择性酶切手段和HPLC、ESI/MS法相结合鉴定了纤溶酶原激活剂中N-连接糖的形式。作者采用CE-ESI-MS和LC-ESI/MS法测定了rHuEPO中O-126的糖基化形式［4］。Kelly等［32］基于醋酸盐缓冲液和涂层毛细管技术提出了表征糖蛋白中糖基化形式的CE-ESI条件。CID技术可有效地用于检测糖蛋白的微观不均一性，测定前可将样品经过化学预处理。总之，ESI/MS是一种表征重组蛋白的有效工具。 4　基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF/MS)的应用 4.1　方法原理 MALDI-TOF/MS即为基体辅助激光解吸离子化技术在飞行时间质谱分析仪中的应用。MALDI-TOF/MS获得的不是扫描谱，它具备内在“任务循环”(duty-cycle)的优点，特别适用于质量动态范围大的分析。灵敏度高，可以快速获取整个质谱图，并能对信号进行累加平均。 在MALDI中，样品与辅助基体产生共结晶是关键，可以通过控制溶剂从惰性表面靶上蒸发的速度来实现。但基体的选择仍是凭经验，对于基体辅助的机理仍然不是十分清楚。常用的基体有芥子酸(SA)和2，5-二羟基苯甲酸(DHB)。 4.2　在分子量、纯度和肽谱测定中的应用 MALDI-TOF/MS可用于研究初期少量或贵重样品的分子量测定，质量准确度达0.01%，对高质量的蛋白测定其灵敏度达amol级［33］，在一次测定中可给出混合物中所有物质的准确分子量，所以该项技术可用于研究样品的纯度和肽谱。 rHuEPO是一种高度糖基化的糖蛋白，无法用ESI/MS测定其分子量，作者采用MALDI-TOF/MS法准确测定了其分子量，纠正了SDS-PAGE法的测定误差；并用MALDI-TOF/MS法研究了rHuIL-2、rHuTNFα、rHuGM-CSF和rHuIFNα等基因工程产品的表达纯度、分子量和样品均一性。同时作者还用该法测定了rHuEPO的肽图，确定了蛋白质的部分氨基酸序列和二硫键位置［34］。 Belleci等［35］用岩藻糖/DHB和岩藻糖/DHB/5-甲氧基水杨酸作基质测定了rHuGH和rHutPA的胰酶肽谱。Tsarbopowlos等［36］测定了rHuIFN-γ和rHuIL-4的胰酶肽图，所测肽片段数分别占理论片段数的95%和88%。 4.3　在糖蛋白微观不均一性测定中的应用 糖蛋白的微观不均一性主要是由糖引起的，这些糖有时对蛋白质的生物学活性会产生不同的影响。由于糖的组分复杂，结构相似，加之糖又没有显色基团，难以不经衍生化就进行光谱、色谱分析，所以糖的分析难度较大。MALDI-TOF/MS可有效地克服这一困难。糖蛋白中的糖主要有两类唾液酸化的酸性寡糖和不含唾液酸的中性糖。Papac等［37］提出以DHB为基体，用反射MALDI-TOF/MS法在正离子方式下测定中性糖组分；以THAP(2，4，6-trihydrotyacetophenane)为基体，用线性MALDI-TOF/MS法，在负离子方式下测定含唾液酸的酸性组分。Powell等［38］采用衍生化的方法将寡糖末端的唾液酸转换成甲基酯，避免了测定过程中唾液酸的丢失，同时也抑制了唾液酸与盐产生的多重MS峰，可在一次正离子方式测定中同时获取中性和酸性糖的信号。 Harmon等［39］提出了一种快速测定由CHO细胞表达的rHuIFN-γ中N-连接寡糖位点的方法，测出了Asn25位点上含有11种分子量不同的糖，Asn97位点上含有13种分子量不同的糖。Cakel等［40］以CE与MALDI-TOF/MS脱机联用的方式测定重组DNA糖蛋白，即先用CE分离糖蛋白的各种糖基化形式，然后收集馏分进行MALDI-TOF/MS分析，该法可用于糖蛋白药物生产过程和批间差异质量控制。Apffel等［41］将单链纤溶酶原激活因子(DSPAα1)经各种蛋白内切酶处理后，用MALDI-TOF/MS测定了其中的糖基化形式。实践表明MALDI-TOF/MS法是一种简便、快速、价廉、灵敏度高、耗样量少，质量动态范围大、对样品基体要求低的方法，在样品靶上直接分析肽谱和利用“源后衰减”(post-source decay)直接分析蛋白结构将会大大提高样品分析的效率和准确度。 5　联用技术的发展 质谱法在一次分析中可提供丰富的结构信息，将分离技术与质谱技术相结合是分离科学方法学中的一项突破性进展。由于GC-MS不能分析热不稳定和不挥发性物质，所以发展了LC-MS和CE-MS法。CE-MS比LC-MS更适合于基因工程类蛋白质的分析，可用于鉴定肽图中的峰、测定糖蛋白的微观不均一性，常用的模式有CZE-ESI-MS、CIEF-ESI-MS和CGE-MS，现在又发展了毛细管电色谱(CEC)与MS的联用，CE与NMR的联用是新近出现的技术，尚未用于基因工程蛋白质的分析，相信是未来基因工程药物质控的发展方向。 6　结语 保证药物的安全有效是生产企业的首要责任，基因工程药物是一类特殊药物，我国目前有数十家大型企业生产重组DNA药品。由于国内质控的手段和设备非常有限，不能用现代仪器方法研究和控制产品的质量变化。由于方法学和检测灵敏度的限制，无法测出制剂中微量主药的纯度和后修饰情况，如何控制这些过程依赖性产品的内在质量呢?笔者认为：首先，生产企业必须严格按照已批准的质量标准控制质量，生产过程严格遵守GMP标准，制订好产品的SOP；其次，积极开展现代仪器法(如CE、MS法)控制产品质量的研究工作，在没有仪器设备的条件下，可跟国内研究院所合作共同研究；第三，我国新药审批部门应强行要求研究单位和生产企业提供CE和MS的分析数据。 作者单位：周国华　南京军区药品检验所南京210002 马剑文　总后卫生部药品仪器检验所 北京100071 罗国安　清华大学生命科学与工程研究院 北京100084 参考文献 1　Frenz J, Wu SL, Hancock WS, et al. Characterization of human growth hormone by capillary electrophoresis.J Chromatogr, 1989,480:379 2　Apffel A, Chakel J, Udiavar S, et al. Application of capillary electrophoresis, high-performance liquid chromatography, on-line electrospray mass spectrometry and matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry to the charaterization of single-chain plasminogen activity.J Chromatogr A,1995, 717:41 3　Mazzeo JR,Martineau JA, Krull IS. Peptide mapping using EOF-driven capillary isoelectric focusing. Anal Biochem, 1993, 208: 323 4　Zhou G-H, Luo G-A, Zhou Y. Application of capillary electrophoresis, liquid chromatography, electrospray mass spectrometry and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry to the characterization of recombinant human erythropoietin. Electrophoresis, 1998, 19:3028 5　Rush RS, Derby PL, Strickland TW, et al. Peptide mapping and evaluation of glycopeptide microheterogeneity derived from endoproteinase digestion of erythropoietin by affinity high-performance capillary electrophoresis. Anal Chem, 1993, 65: 1834 6　Never T, Amankwa LN, Kuhr WG. Trypsin-modified fused-silica capillary microreactor for peptide mapping by capillary zone electrophoresis. Anal Chem, 1992, 64: 1610 7　Chang H-T, Yeung ES. On-column digestion of protein for peptide mapping by capillary zone electrophoresis with laser-induced native fluorescence detection. Anal Chem, 1993, 65: 2947 8　Bonneil E, Waldron KC. Rapid peptide mapping by capillary electrophoresis using CPG immobilized trypsin. In: Tenth International Symposium on High Performance Capillary Electrophoresis(HPCE98). Orlando, FL, USA, 1998. 102 9　Bossi A, Righetti PG, Gelfi C. Gereration of peptide maps by capillary zone electrophoresis in isoelectric iminodiacetic acid. In: Tenth International Symposium on High Performance Capillary Electrophoresis (HPCE98). Orlando, FL, USA, 1998. 152 10　Bede S, Verbeck G, Yang Z-G. Capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection for protein and peptide analysis. In: Tenth International Symposium on High Performance Capillary Electrophoresis (HPCE98). Orlando, FL, USA, 1998. 249 11　周国华，罗国安，周勇等.毛细管电泳及其质谱联用技术分析重组人促红细胞生成素(rhEPO). 分析化学，1998，26(3)：249 12　周国华，罗国安.毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)的接口技术.中国药科大学学报，1997，28(suppl):5 13　Yowell GG, Fazio SD, Vivilecchia RV. The analysis of a recombinant granulocyte macrophage colony stimalating factor (GM-CSF)dosage by capillary electrocapillary isoelectric focusing and high perpormance liquid chromatography. J Chromatogr, 1993, 652:215 14　Wiktorwicz JE, Colburn JC.Capillary Electrophoresis: Theory and Practice. New York: Academic Press, 1992. 287 15　Yowell GG, Fazio SD, Vivilecchia VV. Analysis of a recombinant granulocyte macrophage colony stimulating factor dosage form by capillary electrophoresis, capillary isoelectric focusing and high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A, 1993, 652:215 16　Szoko E. Protein and peptide analysis by capillary zone electrophoresis and micellar electrokinetic chromatography. Electrophoresis, 1997, 18:74 17　Bietlot HP, Girard M. Analysis of recombinant human erythropoietin in drug formulations by high performance capillary electrophoresis. J Chromatogr A, 1997, 759:172 18　林炳承.毛细管电泳导论.北京：科学出版社，1996.188 19　Park SS, Gabriel NE, Chang BS. Quantitation of a dilute protein drug(Interferon alfacon-1) in HAS formulations using capillary electrophoresis. In: Tenth International Symposium on High Performance Capillary Electrophoresis (HPCE 98). Orlando, FL, USA, 1998. 152 20　周国华.生物大分子的表征及结构与活性关系研究.清华大学博士学位论文.1998 21　Yim K W. Fractionation of the human recombinant tissue plasminogen activator(rt PA) glycoforms by high performance capillary zone electrophoresis and capillary isoelectric focusing. J Chromatogr, 1991, 559: 401 22　Thorne JM, Goetzinger WK, Chen AB, et al. Examination of capillary zone electrophoresis, capillary isoelectric focusing and sodium dodecyl sulfate capillary electrophoresis for the analysis of recombinant tissue plasminogen activator. J Chromatogr A, 1996, 744:155 23　James DC, Freedman Rb, Hoare M. Application Information Bulletin. Beckman Instruments, Inc, 1994. A-1764 24　周国华，罗国安，周勇等.高效毛细管电泳分析重组人促红细胞生成素.中国药学杂志，1998，33(7)：424 25　Rilling HC, Brennger E, Epstein WW, et al. Prenylated protein: The structure of the isoprenoid group. Science,1990, 247:318 26　Edde B, Rossier J, Lecaer JP, et al. Posttranslational Glutamylation of α-Tubulin. Science, 1990, 247: 83 27　Smith RD, Loo JA, Edmonds CG, et al. New developments in biochemical mass spectrometry: Electrospray Ionization. Anal Chem,1990, 62: 882 28　Ramanathan R, Gross ML, Zielinski WL, et al. Monitoring recombinant protein drugs: A study of insulin by H/D exchange and electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem, 1997, 69:5142 29　Smith RD, Loo JA, Ogorzalek Loo RR, et al. New developments in biochemical mass spectrometry: electrospray ionization. Anal Chem, 1990, 62:882 30　Rogers G, Rohde MF, Katta V. Microheterogeneity of erythropoietin carbohydrate structure. Anal Chem, 1995, 67: 1442 31　Tsarbopoulos A, Pramanik NP, Nagabhushan TL, et al. Structural analysis of the CHO-derived interleukin-4 by LC-ESI/MS. J Mass Spectrom, 1995, 30: 1752 32　Kelly JF, Locke SJ, Ramaley L, et al. Development of electrophoretic conditions for the characterization of protein glycoforms by capillary electrophoresis-electrospray mass spectrometry. J Chromatogr A, 1996, 720:409 33　Perera IK, Kantartzoglor S, Dyer PE. Some characteristics of matrix-assisted UV laser desorption-ionization mass spectrometric analysis of proteins. Int J of Mass and Ion Processes, 1996, 156:151 34　周国华，罗国安，朱敏生.基体辅助激光解吸质谱法在生物大分子质量研究中的应用.药学学报，1998，33(4)：290 35　Billeci TM. Tryptic mapping of recombinant proteins by matrix laser desorption ionization mass spectrometry. Anal Chem, 1993, 65:1709 36　Tsarbopoulos A.Comparative mapping of recombinant pr-oteins and glycoproteins by plasma desorption and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.Anal Chem, 1994, 66:2062 37　Papac DI,Wong A,Jones AJS.Analysis of acidic oligos-accharides and glycopeptides by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.Anal Chem, 1996, 68(18):3215 38　Powell AK, Harvey DJ. Stabilization of sialic acids in N-linked oligosaccharides and gangliosides for analysis by positive ion matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.Rapid Commun Mass Spectrom, 1996, 10:1027 39　Harmon BJ, Gu X, Wang DIC. Rapid monitoring of site-specific glycosylation microheterogeneity of recombinant human interferon-γ. Anal Chem, 1996, 68: 1465 40　Chakel JA,Jr PE, Hancock WS, et al. Analysis of recombinant DNA-derived glycoproteins via high-performance capillary electrophoresis coupled with off-line matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. J Chromatogr B, 1997, 689:215 41　Apffel A, Chakel J, Hancockk WS, et al. Application of high-performance liquid chromatography-electrospray ionization time of flight mass spectrometry in combination with selective enzymatic modifications in the charaterization of glycoosylation patterns in single-chain plasminogen activitor. J Chromatogr A, 1996, 732:27 收稿日期:1998-09-16 