肝平胶囊中腺苷含量的HPLC分析

施超欧¹ 谢小波¹ 郭丽冰² 郑佳茵²

(1.华东理工大学分析测试中心,上海 200237；2.华东理工大学应用化学系97级,上海 200237)

摘　要:目的：建立肝平胶囊中腺苷含量的测定方法。方法：采用HPLC测定肝平胶囊中腺苷的含量，色谱柱为Kromasil C18柱，流动相为0.05M KH₂PO₄－甲醇 (88:12,V/V, pH4.7)，紫外260nm检测。样品采用10％甲醇水体系超声萃取。结果：加样回收率在98～102%。HPLC分离定量测定，其线性回归方程Y＝2537.4x + 99.96，相关系数r=0.9999，(n＝5）。结论：分析结果良好，可用于生产监控的质量控制。

关键词：肝平胶囊; 冬虫夏草; 腺苷; HPLC

Determination of Adenosine in “Gangping” Capsule by High Performance Liquid Chromatography

SHI Chao-ou¹, XIE Xiao-bo¹, GUO Li-bing², ZHANG Jia-yin²

Abstract: objective: To establish the determination of adenosine in Gangping Capsules.Methods: HPLC method was developed for the determination of adenosine in Gangping Capsules on Kromasil C18(150mm×4.6mm i.d.) in 0.05mol/L KH₂PO₄－methanol (88:12,V/V,pH4.7) as mobile phase(1.0ml/min) . The UV detector was set at 260nm. Adenosine was extracted with 10% methanol water. Results: the recoveries was 98～102 % and the linear equation was Y=2537.4X+100.81，correlation coefficient was r=0.9999(n=5). Conclusion: The method is simple, rapid and accurate.

肝平胶囊由六味中药的浸膏复配而成的中药，用于治疗肝纤维化。发酵虫草粉是六味中药的一味，其有效含量以腺苷含量来表示。关于腺苷的测定文献报道很多，主要有TLC和HPLC^[1~8]，近年来的文献以HPLC为主。对于腺苷的HPLC测定，由于来源不同，不同样品的处理和分析方法各有千秋。我们针对肝平胶囊，通过不同超声时间和溶剂萃取的比较，不同色谱柱分析方法之间的差异比较，不同柱温、pH以及不同缓冲液离子强度对保留时间和分离影响的研究，建立了超声快速萃取、HPLC分离定量测定的分析方法，分析结果良好。

1.1 仪器

岛津 LC－6A液相色谱仪；SPD－6AV紫外检测器；C－R3A色谱数据处理；JHN－M－2E 超声波清洗器（上海杰恩普超声设备有限公司）。

1.2 试剂

甲醇（HPLC级）；腺苷(层析纯)；磷酸二氢钾（A.R.）；二次蒸馏水。

2.1 色谱条件

分析柱：kromasil KR100－5C18（150×4.6mm）；保护柱：phenomenex；流动相：88％0.05M磷酸二氢钾(pH4.7)和12％甲醇（体积百分含量）；流速：1.0ml/min；检测波长：260nm；柱温：26℃。

2.2 标准曲线的绘制

称取标准品50.3mg（98％），置于100ml容量瓶中，用流动相溶解配制成标准储备液（493.0μg/ml），分别移取0.2，0.5，1.0，2.0，4.0ml于50ml容量瓶中，配制成1.97，4.93，9.86，19.71，39.43μg/ml，在上述色谱条件下准确进样20μl。其线性回归方程y＝2537.4x+99.964，相关系数r=0.9999，(n＝5)。线性范围为0.0394～0.788μg。

2.4 供试品溶液的制备与测定

准确称取肝平胶囊内容物约0.8克粉末于50ml容量瓶中，加入10％的甲醇水溶液40ml，振荡溶解后，超声波处理5min（强档），定容至50ml，静置15－30min，取上清液离心10min后，用0.45μm滤膜过滤，进样20μl，峰面积定量。结果见图1、图2。

图1腺苷对照品HPLC图 图2 肝平胶囊HPLC图

采用加样回收法。准确称取肝平胶囊内容物8份，每份约0.8克粉末于50ml容量瓶中，加入不同量的腺苷对照品，以下按供试品溶液方法制备并测定，结果见表1。

3. 讨论

肝平胶囊中腺苷含量的分析，由于存在多种药材，其测定的干扰比较大，进而影响到色谱条件的选择。在实验中我们发现，不同的温度、pH、离子强度、以及色谱柱对腺苷的分离都有很大的关系。

3.2提取方法：本文对超声提取时间进行了研究，由于胶囊水溶性好，即使不超声，摇动一至二分钟，经测定95％ 以上的腺苷已溶于提取溶剂中，因此只需超声5分钟，可以认为提取完全了。

3.3 不同色谱柱之间分析方法的差异：在实验中比较了Kromasil 和 Diamonsil （都为150×4.6mm），二者采用不同的流动相可得到相同的结果，在相同温度下，如果腺苷的保留时间一致，用Diamonsil柱其甲醇含量稍高，而磷酸盐的浓度要比Kromasil低。

3.4 不同柱温、pH、不同缓冲液离子强度对保留时间和分离的影响：在实验中发现，由于样品中成分多，腺苷的保留时间及与其它杂质的分离状况对柱温、缓冲液的离子强度和流动相pH的变化都非常敏感，需要极严格地控制色谱条件，才能保证良好的重现性。

[1] 许妍，梅玲华. 金水宝片质量标准的研究[J].中草药,1999,30(7)：503～505.