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目的：为研究细胞色素P450同工酶 CYP2D6在人群中的代谢多态性，本文建立了人尿中右美沙芬(DM)及其O-去甲基代谢物3-羟 基-N-甲基-吗喃(DT)的气相色谱分析方法。方法：尿样经提取后，以 HP-1毛细管柱作为分离柱，FID为检测器，正二十二烷为内标进行气相色谱分析。结果：在此实验条件下，右美沙芬、内标物和代谢物的保留时间分别为8.5，9.9 和11.2min;尿样中DM在0.10～2.0μg/ml、DT在0.20～20.00μg/ml范围内线性关系良好，回 收率分别95.7%～104.4%(DM)和93.3%～98.3%(DT)；样品测定的RSD分别为2.5% 和3.1%。结论：该法简便可靠，能满足CYP2D6代谢多态性研究的要求 。
关键词 右美沙芬；气相色谱法
右美沙芬(Dextromethorphan,DM)为常用的镇咳药，毒性较小，在人体内经细 胞色素P450同工酶CYP2D6催化氧化代谢生成3-羟基-N-甲基-吗喃(Dextrorphan,DT)。所 以，DM常作为CYP2D6活性测定的化学探针［1］。国内外对体液中DM和DT的测定大多 采用HPLC法［2,3］,本文建立了毛细管气相色谱测定人尿中DM及其代谢物DT的较为简 便、准确的方法，可用于人群代谢分型的研究，也为临床给药个体化提供方法依据。
图1 DM和DT的化学结构
1 仪器与试药
岛津GC-15A气相色谱仪,CR-4A色谱数 据处理机。
右美沙芬(DM)、3-羟基-N-甲基-吗喃(DT)购自Hoffmann-LA Roche(Switz erland)试剂公司，正二十二烷、无水乙醇、乙醚、异丙醇、乙酸乙酯、盐酸、碳酸氢钠、 碳酸钾均为分析纯试剂，L-半胱氨酸为生化试剂。
2 实验方法与结果
2.1 色谱条件
HP-1毛细管柱,0 .22mm×25m;柱温:190℃;进样口温度:260℃;氢火焰检测器(FID),检测器温度：260℃;载气 :N2;分流比50∶1;燃气:H2,50ml/min;助燃气：空气,500ml/min;进样量:2μl。
在上 述实验条件下，尿样中DM和DT分离良好。见图2。
图2 色谱图
A-标准样 品；B-尿样；C-空白尿样；1-DM；2-IS；3-DT
2.2 样品处理方法
受试者在取空白尿后，口服右美沙芬30mg,收集0～8 h的尿样分别量取总体积后，取15～20ml于试管中，用封口胶封好，置冰箱保存。
取尿样2 .5ml(若尿样中DM或DT浓度较低，可酌情增加取样体积)，加入L-半胱氨酸50mg、浓盐酸0 .30ml,在100℃加热30min,冷却后加入乙醚2ml,振荡、离心，弃去上层乙醚层，尿液中加 入12mol/L NaOH溶液0.35ml中和，再加入固体缓冲液(NaHCO3-K2CO3=3∶2)1g,溶解后加入提取液(乙醚-异丙醇=9∶1)2ml振荡、离心，将提取液分离到另一干净 离心管中，再加入提取液2ml提取，离心，将提取液合并到同一离心管中。提取液吹干后， 加入25μg/ml正二十二烷内标溶液50μl定容。
2.3 线性关系 精密称取右美沙芬氢溴酸盐0.0052g(相当于右美沙芬0.0 040g),置于100ml量瓶中，用乙醇溶解定容，即为40μg/ml DM标准液。
精密称取3-羟基 -N-甲基-吗喃酒石酸盐0.0063g(相当于3-羟基-N-甲基-吗喃0.0040g),置于100ml量 瓶中，用乙醇溶解并定容，即为40μg/ml DT标准液。
精密量取一定量DM和DT标准溶液， 吹干后加入空白尿2.5ml,配制成含DM为0.10,0.20,0.30,0.40,0.60,1.00,1.20,1.60和2.00 μg/ml和DT为0.20,0.40,0.80,1.20,1.60,2.00,2.40,3.20,4.00,8.00,12.0,16.0 和20.0μg/ml的标准尿样溶液，按尿样处理方法操作，进样2μl。
以DM(或DT)色谱峰面积与内标峰面积之比(Y)为纵坐标，DM(或DT)浓度( X)为横坐标进行线性回归，求得DM的线性方程为:Y=0.01667X-0.1023,r =0.998;DT的线性方程为:Y=0.01559X-0.4860,r=0.997。结果表明，在DM浓度 0.10～2.00μg/ml、DT浓度0.20～20.00μg/ml范围内线性关系良好。
2.4 回收率
精密量取一定量DM或DT标准溶液，挥干后加入空白尿2.5ml ,配制成DM浓度为0.20,0.80和1.60μg/ml,DT浓度为0.40,8.00和20.00μg/ml的标 准尿样溶液，依上法进行气相色谱分析，将测得量与加入量比较，求得回收率，结果见表1 。
表1 尿中DM和DT的回收率
|
DM |
DT | ||||||||
|
加入量/μg.ml-1 |
测得量/μg.ml-1 |
回收率/% |
平均值/% |
RSD/% |
加入量/μg.ml-1 |
测得量/μg.ml-1 |
回收率/% |
平均值/% |
RSD/% |
|
0.20 |
0.1984 |
99.20 |
|
|
0.40 |
0.3710 |
92.76 | ||
|
0.20 |
0.1842 |
92.10 |
96.7 |
4.2 |
0.40 |
0.3622 |
90.55 |
93.3 |
3.3 |
|
0.20 |
0.1978 |
98.90 |
|
|
0.40 |
0.3864 |
96.59 | ||
|
0.80 |
0.7524 |
94.05 |
|
|
8.00 |
7.726 |
96.58 | ||
|
0.80 |
0.7473 |
93.41 |
95.7 |
3.6 |
8.00 |
7.848 |
98.10 |
98.3 |
1.8 |
|
0.80 |
0.7968 |
99.60 |
|
|
8.00 |
8.008 |
100.1 | ||
|
1.60 |
1.696 |
106.0 |
|
|
20.00 |
18.95 |
94.75 | ||
|
1.60 |
1.688 |
105.5 |
104.4 |
2.2 |
20.00 |
19.14 |
95.70 |
93.6 |
3.0 |
|
1.60 |
1.629 |
101.8 |
|
|
20.00 |
18.08 |
90.40 | ||
2.5 样品测定
取受试者尿样2.5ml(若尿样中DM 或DT浓度太低，则适当增加取样体积)，按上述方法测定，结果见表2。
2.6 方法精密度
取同一受试者尿样重复测定5次，结果其中DM浓度平均 值为0.4910μg/ml,RSD为2.5%;DT浓度平均值为2.624μg/ml,RSD 为3.1%。
表2 样品测定结果
|
受试者编号 |
DM浓度/μg.ml-1 |
DT浓度/μg.ml -1 |
|
1 |
0.6043 |
2.848 |
|
2 |
0.4584 |
1.542 |
|
3 |
0.2817 |
1.477 |
|
4 |
0.2136 |
1.029 |
|
5 |
0.1364 |
2.023 |
|
6 |
0.3955 |
2.956 |
|
7 |
0.0530 |
2.860 |
|
8 |
0.1945 |
0.3189 |
|
9 |
0.1210 |
0.1284 |
|
10 |
0.2174 |
4.906 |
3 讨 论
DM和DT的测定常用HPLC法，采用 GC法时通常先用硅烷化试剂对DT进行衍生化，然后进行GC分析。我们曾经采用文献方法 ［3］以MBTFA和MSTFA为硅烷化试剂进行测定，结果发现色谱峰极复杂，分离度低，测定 重复性差。将硅烷化试样进行GC-MS分析时，除检测到DT的硅烷化产物外，还发现存在DT的 色谱峰，这表明硅烷化不完全，更说明DT无需衍生化可直接进行GC分析。所以在本文中不再 采用硅烷化方法，尿样经提取分离后直接进行GC分析，使样品预处理大为简便，也使色谱图 大为简化。
在本实验条件下，DM、内标物和DT的保留时间分别为8.5,9.9和11.2min,相互之间达到基线 分离；尿样中DM浓度在0.10～1.60μg/ml、DT浓度在0.20～20.0μg/ml范围内线性关系良好 ，回收率分别为95.7%～104.4%和93.3%～98.3%;样品测定的RSD分别为2.5 %和3.1%。
本方法已应用于中国人群中CYP2D6代谢多态性的研究。
浙江省自然科学基金第396486号
吴永江（杭州 310031 浙江大学湖滨校区药学 院药物分析教研室）参考文献
［1］Cai WM,Chen B,Liu YX.Deteromethorphan metabolic p henotyping in a Chinese population.Acta Pharmacologica Sinica,1997,18(5)∶441.
［2］Schmid B,Bircher J,Preisig R,et al.Po lymorphic dextromethorphan metablolism:Co-segregation of oxidative O-demethyla tion with debrisoquine hydroxylation.Clin Pharmacol Ther,1985,38∶618.
［3］徐友宣，申利，张长久，等.人尿中美沙芬及其代谢产物 的气-质联用分析.药学学报，1993，28(2)∶156