摘要：建立了毛细管电泳分离-激光诱导荧光检测(CE-LIFD)分析分枝杆菌脱氧核糖核酸(DNA)限制性内切酶谱的新方法。用聚合酶链反应(PCR)扩增分枝杆菌hsp65基因的长度为439 bp的片段，该扩增片段经限制性内切酶BstEII和HaeⅢ酶切后，分别用CE-LIFD装置和常规琼脂糖电泳(AGE)对比检测酶切片段。对PCR扩增片段的酶切样品的预处理和CE条件进行了优化，获得了8种分枝杆菌DNA的限制性内切酶谱图。DNA片段相对迁移时间的相对标准偏差(RSD)≤3.6％。结果表明，CE的分离效能明显高于AGE，是研究DNA限制性内切酶谱的更有效的检测手段。
关键词：毛细管电泳；激光诱导荧光检测；限制性内切酶谱；分枝杆菌
以
结核病为代表的分枝杆菌病已经对全人类的健康形成了极大的威胁，能否对其进行正确的诊断和治疗，主要取决于对分枝杆菌的分离和鉴定。传统的病原学鉴定方法是先进行细菌的分离和培养，然后再进行生化鉴定。由于分枝杆菌生长缓慢，该法耗时长，且生化
检验项目多，因此不利于
临床早期诊断和治疗。
随着分子生物学技术的不断发展，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和PCR-限制性内切酶谱分析(PCR-restriction enzyme pattern analysis，PRA)等在分枝杆菌中的分类和鉴定中逐步得到了应用。经典的PRA采用琼脂糖凝胶电泳电泳(capillary electrophoresis，CE)是近年来发展十分迅速的分离分析方法，与传统的电泳方法相比，具有分辨率高、分离速度快、样品用量少(nL级)、分析成本低等优点，特别是采用激光诱导荧光检测(LIFD)又使毛细管电泳法的灵敏度大为增加。根据酶切后脱氧核糖核酸(DNA)片段多态性的差异，可分析基因组的同源性，并进行个体分类鉴定，在
微生物研究领域有广阔的应用前景 。
hsp65基因存在于所有分枝杆菌中，编码一种相对分子质量为65000的细胞壁抗原蛋白。该基因全长约1300bp。Telenti等设计引物扩增了该基因第398至第836碱基对之间的片段，并采用限制性内切酶对扩增片段进行酶解，经AGE分析其DNA片段长度，发现大多数分枝杆菌具有独特的内切酶图谱，可以用于分枝杆菌的鉴别。贺小玲等采用AGE对临床标本中的分枝杆菌属进行了鉴定。本研究以分枝杆菌的hsp65为目的基因，采用一对引物扩增出该基因中长度为439bp的特征片段，经限制性内切酶BstEⅡ和HaeⅢ酶切后，分别用CE和AGE分离酶切片段，对分枝杆菌进行分类鉴定，以建立快速、可靠的鉴定方法，对结核病的早期诊断及预防具有重要意义。
1 实验部分
1．1 仪器与试剂
毛细管电泳-激光诱导荧光检测装置(自行组装，包括氦氖激光器(543.5nm，JDS Uniphase))，参数控制和数据采集用本实验室编制的Windows软件。毛细管柱(河北永年光导纤维厂)，柱内表面的聚丙烯酰胺化学键合涂层由本实验室制备 ，涂渍后的毛细管内充0.01mol／L H3PO4保存。UNO型PCR仪(德国Biometre公司)。柱式细菌DNA抽提试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)。
草分枝杆菌(Mycobacterium phlei，M．phlei，CMCC(B)93318)、蟾分枝杆菌(M．xenopi，CMCC(B)93316)、偶发分枝杆菌(M．fortuitum，CMCC(B)93323)、变黄分枝杆菌(M．flavescens，CMCC(B)93322)、迪氏分枝杆菌(M.diernhoferi，CMCC(B)93320)、结核分枝杆菌(M．tuberculosis，CMCC(B)93020)和牛分枝杆菌(M．bovis，CMCC(B)93006)标准参考菌株购自中国药品生物制品检定所。龟分枝杆菌脓肿亚种(M．chelonei subsp．abscessus)临床分离株由深圳市卫生防疫站提供。 限制性内切酶BstEⅡ和HaeⅢ(上海生工生物工程技术服务有限公司)；Taq DNA聚合酶，dNTPs(deoxyribonucleoside 5-triphosphates)，pUC 19DNA/Msp I(HpaⅡ)Marker 23(华美生物工程有限公司)；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。溴乙啶、甲基纤维素购自美国Sigma公司。
1．2 实验方法
1．2．1 分枝杆菌基因组DNA的提取和PCR扩增
在罗氏培养基上，取培养物1～2接种环，加灭菌重蒸水1.5mL，研磨成混悬液，用DNA抽提试剂盒提取。PCR反应液含有模板DNA 2μL，l0×缓冲液5μL，dNTPs 4μL，引物p1、p2各1μL，灭菌高纯水35.5μL，Taq酶(3 U／L)1.5 μL；总体积50μL。PCR反应条件为：预变性94℃(5min)，变性94℃(1min)，退火58℃(1min)，延伸72℃(1min)，循环数35，最后保持在72℃(5min)。
1．2．2 限制性内切酶酶切
将PCR扩增产物分别用限制性内切酶BstEⅡ和HaeⅢ进行酶切。分别取PCR产物20μL，灭菌高纯水23μL，l0×酶缓冲液5μL，限制性内切酶(10U／L)2μL。反应体系总体积为50μL，反应条件为37℃(1h)。
1．2．3 高效毛细管电泳-激光诱导荧光检测
调整好CE-LIFD装置的光路系统。在电泳分析前，将毛细管柱先填充0.1％(质量分数)甲基纤维素，再充入加有DNA 内插荧光试剂溴乙啶的0.5％(质量分数)甲基纤维素，分离所用的缓冲溶液为TBE溶液(45mmol／L三羟甲基氨基甲烷45mmol／L硼酸-l0mmol／L乙二胺四乙酸，pH 8.5)。分别取pUC19DNA／Msp I(HpaⅡ)Marker 23、PCR扩增产物、BstEⅡ酶切产物和HaeⅢ酶切产物各10μL，加入内标2μmol／L kiton red(购自sigma公司)1μL，以l0kV×15s电动进样，采用在1lkV恒压电泳模式，用激光诱导荧光检测DNA片段。每次电泳后用0.01mol／L H3PO4冲洗毛细管5min，再进行下一次检测。
1．2．4 琼脂糖凝胶电泳
分别取PCR扩增产物、BstEⅡ酶切产物和HaeⅢ酶切产物各10μL，加6×上样缓冲液2μL，混匀，将样液加到2％(质量分数)的琼脂糖凝胶板(含溴乙啶)上，电泳场强为8～10 V／cm，电泳70 min。取下凝胶，于凝胶成像仪上观察电泳图谱。
2 结果与讨论
2．1 DNA 样品的预处理
分枝杆菌基因组DNA提取后，该提取样品经PCR扩增后可以直接进行毛细管电泳检测，但PCR扩增片段的酶切样品直接用于电泳分析时灵敏度低，分离效果差。这是由于酶切样品浓度低、进样量极微，且含有MgC12等盐类可能干扰毛细管电泳，因此需对样品进行预处理。我们试验了PCR扩增纯化试剂盒、真空干燥、乙醇沉淀等几种处理方法，结果表明，采用乙醇沉淀酶切样品中的DNA，在0℃下高速离心，去除上清液，用N2吹干残留的乙醇，用电泳缓冲溶液定容后进行检测，处理方法简单，样品浓缩后能提高检测灵敏度。
2．2 毛细管电泳分离条件的选择
采用不同内径和长度的内壁处理过的3支石英毛细管柱(内径为75μm，有效长度分别为50cm和65cm；内径为100 μm，有效长度为50cm)进行试验。结果表明，内径为100μm，有效长度为50cm的毛细管用于分离pUC19DNA／Msp I(HpaⅡ)Marker 23的11个DNA片段和分枝杆菌PCR-限制性内切酶产物，灵敏度较高，分离效果较好。
分别采用l0mmol／L的硼酸盐溶液和TBE溶液(pH8.5)作为电泳缓冲溶液进行实验。结果表明，用TBE溶液作为电泳缓冲溶液分离DNA片段分辨率高，电泳峰形好。改变TBE缓冲溶液的浓度(10～60mmol／L)进行试验，当电泳缓冲溶液的浓度偏低时，电渗流加快，有效淌度减小，CE分辨率降低，DNA片段的分离效果变差；当缓冲溶液的浓度偏高时，电流偏大，焦耳热效应使轴向扩散增加，分离效率也受到影响。本实验选用45mmol／LTBE溶液作为电泳缓冲溶液。
电泳电压对分枝杆菌DNA 的PCR扩增产物和酶切产物的迁移时间有显著的影响。改变电泳电压(8～15 kV)，考察本实验中所用pUC19DNA／Msp I(Hpa Ⅱ)Marker 23的11个DNA片段的分离情况。结果表明，随着电压的增加，Marker的DNA片段的迁移时间不断减少，电泳分析的时间也减少，有利于提高分析速度；但是当电压太高时，331，404，489和501bp片段的电泳峰部分重叠，不能达到基线分离，故本实验选用的电泳电压为11kV。
综合考虑检测灵敏度和基线噪声，将光电倍增管的负高压设定为-1000V。由于分枝杆菌DNA经PCR扩增后的酶切产物浓度较低，如果进样电压太低和时间太短，往往不能检出小片段的DNA，因此本实验选用进样电压为l0kV，进样时间为15s。
根据上述实验结果，本实验选用的最佳电泳条件为：采用内径为100μm、有效长度为50cm的内壁处理过的毛细管柱，以45mmol／L TBE溶液作为电泳缓冲溶液，分离电压为11kV。pUC19DNA／Msp I(Hpa lI)Marker23的11个DNA 的片段，除了1l0和111bp，489和501bp不能分离外，其余片段均可完全分离。龟分枝杆菌DNA的PCR扩增产物在此条件下的毛细管电泳图。
2．3 DNA 片段相对迁移时间的重现性
DNA片段迁移时间的重现性是基因分析中的重要指标之一。在DNA 的毛细管电泳研究中，我们对所研究的DNA片段的迁移时间重现性进行了考察。在待测试样中加入荧光试剂kiton red作为内标物，采用相对迁移时间以消除进样时间和电场的不稳定对迁移时间的影响。根据标记物和试样中DNA片段的相对迁移时间，可以确定待测试样中DNA片段的大小。在本实验的条件下，所测pUC19DNA／Msp I(Hpa lI)Marker 23的DNA片段的相对迁移时间具有很好的重现性，其相对标准偏差(RSD)≤1.67％。分别对草分枝杆菌和龟分枝杆菌脓肿亚种临床分离株的BstE Ⅱ酶切产物进行了3次重复测定，其DNA片段相对迁移时间的RSD≤3.6％。
2．4 CE-LIFD 分析
对8种分枝杆菌DNA 的PCR扩增产物、BstEⅡ酶切产物和HaeⅢ酶切产物分别进行了CE-LIFD分析，其中草分枝杆菌、龟分枝杆菌脓肿亚种l临床分离株和蟾分枝杆菌DNA 的PCR扩增产物的BstEⅡ酶切产物和HaeⅢ酶切产物的毛细管电泳谱图。
2．5 与AGE方法的比较
同时对草分枝杆菌、龟分枝杆菌脓肿亚种临床分离株和蟾分枝杆菌DNA 的PCR扩增产物、BstEⅡ酶切产物和HaeⅢ酶切产物进行了AGE分离。
通过对CE和AGE谱图的比较可知，用这两种方法得到的分枝杆菌DNA的限制性酶切谱图具有可比性。两种方法得到的分枝杆菌DNA的PCR扩增产物的片段是一致的，限制性酶切谱图的指纹条带形状基本相同，但是对酶切后的DNA片段大小确定有一定的差异，有时可能相差10～15bp，其原因可能是两种方法对DNA片段的鉴别能力不完全相同所致。虽然AGE是分离DNA片段的常用手段，但限于凝胶的长度(一般不超过15cm)和施加的电泳电压低，某些大小相近的片段不能较好地分离，因此根据所用的标记物和限制性酶切谱图确定DNA片段大小时，误差较大。CE中所用的毛细管通常为数十厘米，同时采用了上万伏的电压，能更有效地分离差异较小的片段，并能在较短的时间内完成分析。本实验中，在试样中加入内标物，采用相对迁移时间消除了进样时间和电场不稳定的影响，在确定试样中DNA片段时更为准确，对于AGE不能检出的小片段也能鉴定，能有效地用于分枝杆菌基因的限制性酶切谱图分析。
3 结论
本文以分枝杆菌的DNA为研究对象，采用CE-LIFD检测了多种分枝杆菌hsp65基因PCR产物的限制性内切酶产物的特征电泳谱图，建立了分枝杆菌的快速、可靠的鉴定方法。本方法能在24min内完成PCR产物酶切片段的分离，得到不同分枝杆菌各自特异的DNA酶切谱图，可用于分枝杆菌的种属鉴别研究。
参考文献：
[1] Stebbins M A，Schar C R，Peterson C B，Sepaniak M J．J Chromatogr B，1997，697：181
作者：
2007-5-25