兽药残留分析技术研究进展

　　随着兽药的种类和应用规模剧增，人们对兽药残留问题的日益关注以及国际间贸易等原因，使兽药残留分析对象、样本数量和测定难度大大增加，迫切需要发展简便、快速、灵敏，并能同时处理测定大批量样品的兽药残留分析技术。

　　传统的波谱、色谱等理化分析手段难以适应兽药残留分析的要求。

　　近年来在兽药残留分析领域所取得的重要进展或发展趋势主要有以下方面：

　　① 样品分离纯化技术（提取和净化方法）的简单化、微型化和自动化，提高了提取或净化效率及自动化水平。如固相萃取法（SPE）、固相微萃取（SPME），超临界流体萃取(SFE)、微波萃取法（MAE）、免疫亲和色谱（IAC）技术、基质固相分散（MSPD）技术，凝胶渗透色谱（GPC）净化，分子印迹技术等。②在定量分析上的新技术包括毛细管电泳、超临界流体色谱、液相色谱-质谱联用技术、免疫分析技术和生物传感器等。下面将这些研究进展作一综述。

　　一、样品分离纯化技术

　　动物性食品中兽药残留的特点是样品中残留物水平很低，样品基质复杂，干扰物质多，不易从样品中分离、纯化残留物。因此兽药残留分析是复杂生物样品基质中痕量组分的分析技术，样品的分离纯化是兽药残留分析中最费时和劳动强度最大的步骤。传统的样品制备技术如液- 液分配等仍在广泛使用，同时一些新的样品分离纯化技术也不断被引入到兽药残留分析中。免疫亲和色谱技术、分子印迹技术、基质固相分散技术、超临界流体萃取 (SFE)等是残留分析中最有效的分离纯化方法，目前是兽药残留分析领域中的研究热点。

　　（一）免疫亲和色谱技术

　　免疫亲和色谱技术（IAC）是用色谱柱技术，把抗体固定在适当的支持物上，制备出用于药物残留检测的样品分离纯化IAC柱。利用抗体与抗原或半抗原可逆的生物专一性相互作用来净化和富集分析物。它的特点是具有高度的选择性和特异性，特别适用于复杂样品基质中痕量组分的分离。该技术的关键是选择合适的支持物、合适的抗体和合适的淋洗缓冲液。该技术的发展方向是使生物样品中多个药物同时得到高效分离纯化。将IAC作为理化测定技术的样本净化手段，避免了免疫分析直接测定样本的诸多不足，IAC 的高选择性和高效性无疑使样本前处理大大简化，通常一次层析即可使待测物得到高度净化和富集，并提供了待测物的定性信息; 使用多种抗体制备的I A C 柱(MIAC)使免疫分析实际具备了处理多残留组分的能力。这种联用技术无论在理论上还是实践上都是相当完善的分析方法，如组织中氯霉素、阿维菌素/伊维菌素的测定。MIAC 是兽药残留免疫净化方法的重要发展方向。

　　（二）分子印迹技术

　　分子印迹技术在残留分析领域的应用研究国外才刚刚起步，是残留分析研究领域的一个新的发展方向。分子印迹技术是利用高分子合成手段制备出能选择性吸附待测物的功能高分子材料，将此种分子印迹聚合物作为固定相，利用色谱柱技术制备出药物残留检测的样品分离纯化柱的技术。

　　与生物抗体相比，分子印迹聚合物兼具了免疫吸附材料的高度选择性和常规理化分离材料的理化稳定性，制备简便省时，易于实现工业化生产。分子印迹技术既可以用于单个药物残留分析，也可以建立和实现生物样品中药物的多残留分析，具有广阔的发展前景。

　　分子印迹的原理是首先使拟被印迹的分子与聚合物单体键合，键合方式有共价结合或非共价结合两种。然后将聚合物单体交联，再将印迹分子从聚合物中提取出来，聚合物内部就留下了被印迹分子的印迹。分子印迹技术可以用于药物、激素、蛋白质、兽药、氨基酸、多肽、碳水化合物、辅酶、核酸碱基、甾醇、染料、金属离子等各种化合物分离工作。

　　除分离作用外，此项技术还可用于制备人工抗体和受体，生物传感器类似物等。

　　（三）基质固相分散萃取技术

　　基质固相分散萃取技术的原理是将涂渍有C18 等各种聚合物的担体的固相萃取材料与动物组织样品一起研磨，得到半干状态的混合物并将其作为填料装柱，然后用不同的溶剂淋洗柱子，将各种待测药物洗脱。基质固相分散萃取技术的优点是不需要进行组织匀浆、沉淀、离心、pH 调节和样品转移等操作步骤。此法适用于药物的多残留分析，特别适合于进行某一类化合物的分离或单个化合物的分离。

　　（四）超临界流体萃取(SFE)

　　近几年，超临界流体萃取(SFE)的发展很快，这种分离手段已经应用于各个方面。超临界流体本质上是处于临界温度以上的高密度气体，既具有气体粘度小、扩散速度快、渗透力强的特点，又具有液体对样品溶解性能好，可在较高温度下操作的特点。一般常用的是超临界CO2，也可以加入适量极性调节剂，如甲醇等来调节其极性，据此可最大限度地提取不同极性的兽药残留而最低限度地减少杂质的提取。应用超临界流体可以对被分析样品进行连续提取，提取效率高，并且可以通过调节温度、压力和添加适当极性调节剂来选择性提取某种目标分析物。流出液中的二氧化碳在常压下挥发，待测物用溶剂溶解后可直接进行分析检测。SFE具有选择性好、前处理简单、分离时间短、完全避免了有毒有机溶剂的使用等优点。其缺点是实验条件的选择和优化比较困难，萃取体系的可选择性差，仪器价格昂贵。

　　二、免疫分析技术

　　免疫分析技术（IAs）是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术，小分子量的兽药(MW<2500)一般不具备免疫原性，不能刺激动物产生免疫反应。将兽药小分子以半抗原的形式通过一定碳链长度的连接分子与分子量大的载体(一般为蛋白质)以共价键相偶联制备成人工抗原，以人工抗原免疫动物，使动物的免疫系统发生应答反应，产生对该兽药具特异性的活性物质(免疫球蛋白或称抗体)来识别该兽药分子并与之结合。这样结合反应不仅可在体内进行，也可在体外进行，符合质量作用定律，这就是免疫分析的基础。

　　一旦制备出特异性抗体， IAs有许多模式供选择，灵活多样，新的分析手段和应用不断出现，这是几十年来对IAs 的研究经久不衰的重要原因。按照标记物或检测体系来划分，IAs 可分为放射免疫测定法（RIA）、酶免疫测定法(EIA)、荧光免疫测定法(FIA)、化学发光免疫测定法(CIA)、固相免疫传感器等；按反应介质分为均相或非均相免疫测定法。与常规理化分析技术相比， 免疫分析具有特异性强、灵敏度高(检测限可达1 μ～1pg)、方便快捷、分析容量大、分析成本低、安全可靠等优点。样本前处理步骤最能体现IAs 的优越性。常规的理化

　　测定技术，如高效液相色谱(HPLC)或GC，通常需要繁琐的样本前处理操作(样本提取、净化、浓缩和衍生化)，前处理至少占用70%以上的分析工作量。IAs有很高的选择性，前处理要求简单，一般仅需提取就足够了，少数情况如高脂肪样本需一定净化步骤;IAs 有很高灵敏性，可使用稀释样本或提取液的方式消除基质的干扰，能进一步简化操作，如动物组织中氯霉素、磺胺二甲基嘧啶和阿维菌素残留的测定。

　　IAs 取样量少、前处理简单、仪器化程度低，分析效率约为HPLC或GC的几十倍;IAs 不存在HPLC 或GC 对待测物蒸气压、热稳定性、卤素、发色团等理化性质的限制，特别适用于难气化或难分离的高极性/离子型兽药、或大分子化合物的分析。IAs 已在大批量样本中某些兽药残留的快速筛选性检测和常规分析技术测定困难的兽药的分析中占据主流地位。

　　（一）酶免疫测定法（EIA）

　　酶免疫测定法是7 0 年代发展起来的非同位素IAs，其使用酶进行标记，避免了同位素标记的放射性污染和标记物的稳定性问题，操作方便，仪器简单。在兽药残留快速分析中应用最广泛的是酶联免疫吸附测定法(ELISA)，目前望尔生物公司等食品药残检测技术研究单位已有近二十多种用于兽药残留检测的商品化ELISA试剂盒。

　　ELISA 检测方法属于非均相免疫分析技术，一般将抗原或抗体吸附于固相载体（包被抗原或抗体），加入酶标记抗原或抗体，以及待测物，进行竞争性免疫反应，反应达平衡后，倾去反应液，洗涤酶标板，即从非标记物中物理分离结合的标记物，再加入酶的底物，进行酶促反应约30分钟，经酸固定停止显色反应后，再用分光光度法进行检测。由于近年来各专业性公司在包被抗原、特异性抗体（尤其是单克隆抗体）、酶、显色系统制备方面，以及在ELISA 反应条件、缓冲液系统的研究方面取得了突破性进展，使商业化ELISA 试剂盒无论在灵敏度、稳定性、精密度方面均达到了兽药残留检测的要求，加上其操作简便、仪器化程度低和成本适中等优点，ELISA 试剂盒已成为目前国内外兽药残留检测的主流技术。

　　（二）荧光免疫测定法(FIA)

　　荧光免疫测定法(FIA)为仅次于 EIA 的非同位素IAs，使用普通光激发荧光物质的FIA，由于易受背景干扰等原因，限制了FIA的灵敏度。近年来发展起来的荧光偏振免疫测定法（FPIA）、荧光淬灭免疫测定法（F Q I A ）和时间分辨荧光免疫测定法（TrFIA），大大提高了FIA 的灵敏度（可达10-10～10-11mol/L）。使得FIA 在环境监测、医学和药物残留方面的应用得到进一步发展。

　　荧光偏振免疫测定法（FPIA）是一种使用荧光物质作为标记物的免疫测定法，使用普通光激发荧光物质后得到的都是普通荧光，当使用偏振光作为激发光时，视分子的运动状态，发射的荧光可能是振动方向随机化的普通荧光，或是只在某一平面振动的偏振荧光。在反应液中，游离的标记药物分子体积小，在布朗运动中转动速度快，受偏振光照射后产生荧光的偏振方向被分散（随机化），不能形成偏振光，只发射普通荧光；与抗体结合的标记药物分子体积大，布朗运动速度缓慢，甚至不能转动而形成定向排列，所以受偏振光激发后能产生偏振荧光。该方法灵敏度高，抗背景干扰性强，适用于复杂基质中痕量组分的分析。

　　（三）胶体金免疫测定法

　　胶体金免疫测定法是在免疫渗滤的基础上建立的一种简单快速的免疫学检测技术，它往往以条状纤维层析材料为固相（通称试纸条），通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体（如抗体或抗原）发生高特异、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截

　　流在层析材料的一定区域（检测带），通过酶反应或直接运用可目测的标记物（如胶体金）而得到直观的实验现象（如显色）。而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。

　　1971 年，Faulk 和Taylor 首次用胶体金标记技术研究沙门氏菌细胞抗原成分，将胶体金与抗原结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。随后胶体金技术不断发展，出现了标记抗球蛋白抗体的间接免疫金染色法，并开始应用于各种药物残留和环境分析中。这种方法灵敏度较高，操作简便快速，分析结果易

　　判定，特别适用于残留监控中现场的快速筛选性监测分析。

　　（四）免疫传感器

　　免疫传感器是生物传感器的一种，传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的目标分析物之间通过抗体与抗原之间的识别反应，产生一些物理化学信号(如光、热、声、质量、颜色、电化学等)的变化，这些变化通过不同原理的传感器( 如光敏管、压电装置、光极、热敏电阻、离子选择性电极等)转换成第二信号(通常为电信号)，经放大后显示或记录。利用兽药与特异性抗体结合反应特性研制出的免疫传感器，可用于对相应兽药残留进行快速定量定性检测。

　　免疫传感器的最大特点是便携性，免疫传感器高度的自动化、微型化与集成化减少了对使用者及环境技术条件的依赖，测定速度快，适合现场或野外进行快速筛选检测。

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　　三、仪器分析

　　（一）毛细管电泳(CE)技术

　　毛细管电泳的工作原理是使用毛细管柱内的不同带电粒子（离子、分子或衍生物）在高压场作用中移动的速度不同来进行分离检测，常用的检测器为ＵＶ。根据样品组分在背景缓冲液中所受作用的不同，又被分为毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、等电聚焦、胶束电动色谱、等速电泳等。自八十年代Jorgenson 把CE 应用于分析化学以来，这一技术已发展成为分离科学中最活跃的领域之一。目前，它已广泛地应用于生物大分子等领域的分离及有机小分子和无机离子的分析中。ＣＥ的优点是分离速度快，分离效果好。与HPLC 相比，CE 所需的样品量极少，仅为几纳升。

　　CE 目前还处于发展阶段，虽然某些物质定量分析重复性不如HPLC，检测限也比较高，但近年来高灵敏度的检测器在CE 上的联用，例如激光诱导荧光检测器、质谱等，可使检测限达到10-14～10-15g。目前，利用CE进行兽药残留分析的报道不是很多，相信不久它将得到广泛的应用。

　　（二）超临界流体色谱(SFC)技术

　　超临界流体色谱法(SFC)是一种崭新的分离分析技术， 是以超临界流体作为色谱流动相的超临界流体色谱。超临界流体色谱(SFC)可以使用各种类型的较长色谱柱，可以在较低温度下分析分子量较大、对热不稳定的化合物和极性较强的化合物，它综合利用了气相色谱和高效液相色谱的优点， 弥补GC和HPLC的不足，可以与大部分GC 和HPLC 的检测器相连接，如FID、FPD、NPD 以及MS 等连用。这样就极大地拓宽了其应用范围，许多在GC或HPLC 上需经过衍生化才能分析的兽药，都可以用SFC 直接测定。

　　SFC 的优点是分离效果好，选择性好，可以连接GC或HPLC 的检测器，通用性好。而且SFE 与SFC 还可以直接连接，使分析时间更短，分析结果更好。SFC 的缺点是仪器价格昂贵，而且仪器本身的一些问题没有解决，在兽药残留分析中应用并不是很多。

　　（三）色谱-质谱连用技术

　　药物残留研究中，常用的色谱法具有高效的分离能力和高灵敏度的定量检测能力，但仅显示色谱峰和保留值，不能提供待测物残留组分的结构信息或对未知化合物进行结构鉴定。质谱等具有很强的结构鉴定能力，但只适用于纯物质的分析，自身不具备分离能力，两者结合特别是联用仪器可以集高效分离和结构鉴定于一体，是生物样品复杂混合物中痕量组分定性和定量分析的最有效手段之一。

　　国内外将液谱- 质谱联用技术用于兽药残留尤其是多残留分析才刚刚开始，目前大部分报道主要集中在兽药残留的液谱-单个质谱联用技术的研究上，LC/MS 主要有四种接口技术：热喷雾(TSP)、粒子束(PB)、电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)。高效液相色谱(HPLC)及大气压电离质谱 (APIMS)主要用来分析低浓度(μ g/L)、难挥发、热不稳定和强极性兽药。液谱-串联质谱（LC/MS/MS）联用技术在兽药残留分析中尚极少应用。

　　另外，色谱/质谱联用检测技术对待测残留物纯度的要求极为严格，一般的样品前处理技术很难达到满意程度。

　　各种分析技术联用是现代分析化学的发展特点，联用技术可以取长补短，获得单一分析技术难以达到的效果。将免疫分析技术与常规理化分析技术联用，可避免单独 IAs 信息量太少等缺欠，并且弥补了理化分析方法选择性差等不足，使整个分析方法简化或进一步提高检测效率，显示了免疫分析与理化分析在分析机制方面的互补性，其中最引人注目的是免疫分析技术与HPLC 的联用。

　　IAC-HPLC 或IAC-GC联用技术中，将IAC 作为理化测定技术的样本净化手段，避免了IAs直接测定样本的诸多不足，IAC的高选择性和高效性无疑使样本前处理大大简化。 HPLC-IA 系一种将HPLC 的强大分离效能与IAs 的高选择性、灵敏性相结合的联用技术，适用于常规检测器无响应或极难分离的残留组分的测定。高效免疫亲合色谱(HPIAC)使用耐压的免疫吸附剂做填料，可看作IAC的高选择性与HPLC 高效分离的合壁，具有对极少量样本或提取液直接测定的能力。

　　兽药多残留的IAC 分离纯化技术是LC-MS-MS 和GC-MS 检测兽药残留时最有效的分离纯化手段。建立动物性食品中药物多残留的定量确证检测技术（IAC-GC-MS、IAC-LC-MS-MS），是残留分析研究领域的一个重要发展方向。