毛细管电泳技术及其在蛋白质分析中的应用

　　                                                           来源：东方医药网

　　摘要：介绍毛细管电泳技术的发展及其在蛋白质分析中的地位，应用的发展及以后发展的趋势。

　　关键词：毛细管电泳技术，应用，蛋白质分析

　　毛细管电泳高效分离、快速分析和微量进样的有时，使其在化学、生命科学、药物学、法医学、环境科学、农学及食品科学等领域有着十分广泛的应用，适合于从无机离子到射干物大分子，从荷电粒子到中性分子的分离分析。HPCE最大的优点之一就是应用范围广泛，可用于分析氨基酸、手性药物、维生素、杀虫剂、无机离子、有机酸、染料、表面活性剂、肽和蛋白质、糖类、低聚核苷酸和DNA限制性内切片段，甚至整个细胞和病毒颗粒。

　　一、毛细管电泳技术简介

　　毛细管电泳（CE）又称高效毛细管电泳（HPCE）或毛细管分离法（CESM），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，它迅速发展于80年代后期。毛细管电泳技术实际上包含电泳技术和色谱技术及其交叉内容，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使细胞分析，乃至单分子分析成为可能。长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。

　　1.1毛细管电泳的沿革

　　毛细管电泳方法虽新，但历史悠久。以毛细管等速电泳（CITP）的发展为起点可以追溯到1960年甚至更远；多数学者以毛细管区带电泳的出现为起点（CZE）。CZE是瑞典科学家Hjerten首先提出的。1981年Jorgenson和Lukacs使用75umID的熔融石英毛细管做CZE，利用电迁移进样和荧光检测，在30kV电压下产生了4X105片/m的效率,成为毛细管电泳史上的一个里程碑。Hjerten先后提出了毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦法，它们不仅可以大副提高效率，而且可以实现自动化操作，便于定性定量工作。1986年，Lauer报道其在蛋白质CZE中获得了106片/m的高效率.这些研究结果激发了关于CE研究的热潮。而1988年美国Bio-Rad公司商品仪器的推出，更加使毛细管电泳技术的发展进入了应用的新时代。

　　１.2毛细管电泳技术的基本定义：

　　毛细管电泳是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现的电泳分离分析方法。

　　1.典型毛细管电泳实验的步骤为：

　　1）将运行缓冲液充满毛细管柱；

　　2）移去进样端缓冲液池，用样品代替；

　　3）用电动或压力进样方式进样；

　　4）将进样端缓冲液放回；

　　5）毛细管两端加操作电压进行电泳分离；

　　6）分离样品迁移至检测窗口检测，数据记录和处理。

　　1.4目前毛细管电泳的分离模式：

　　1)毛细管区带电泳（CZE）Capillaryzoneelectrophoresis，用以分析带电溶质。为了降低电渗流和吸附现象，可将毛细管内壁涂层。

　　2)毛细管凝胶电泳（CGE）Capillarygelelectrophoresis，在毛细管中装入单体，引发聚合形成凝胶，主要用于测定蛋白质、DNA等大分子化合物。

　　3)胶束电动毛细管色谱（MEKC）Micellarelectrokineticchromatography，在缓冲液中加入离子型表面活性剂如十二烷基硫酸钠，形成胶束，被分离物质在水和胶束相（准固定相）之间发生分配并随电渗流在毛细管内迁移，达到分离。本模式能用于中性物质的分离。

　　4)亲和毛细管电泳，在毛细管内涂层或在凝胶在中加入亲和配基，以亲和力的不同达到分离目的。

　　5)毛细管电色谱（CEC）Capillaryelectrochromatography，是将HPLC的固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂布固定相，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程，此模式兼具电泳和液相色谱的分离机制。

　　6)毛细管等电聚焦（CIEF）Isoelectricfocusing，是通过内壁涂层使电渗流减到最小，再将样品和两性电解质混合进样，两个电极槽中分别为酸和碱，加高电压后，在毛细管内建立了pH梯度，溶质在毛细管中迁移至各自的等电点，形成明显区带，聚焦后用压力或改变检测器末端电极槽储液中的pH值使溶质通过检测器。

　　7)毛细管等速电泳（CITP）Capillaryisotachophoresis，采用先导电解质和后继电解质，使溶质按其电泳淌度不同得以分离。

　　8)CE/MS联用，CE的高效分离与MS的高鉴定能力结合，成为微量生物样品，尤其是多肽、蛋白质分离分析的强有力工具。可提供分子量及结构信息，适于目标化合物分析或窄质量范围内扫描分析，如多环芳香碳氢化合物（PAH）、寡聚核苷酸分析等。

　　二、毛细管电泳技术在蛋白质分析中的应用

　　毛细管电泳技术在蛋白质分离及其相关领域中的应用内容很多。

　　毛细管电泳在蛋白质和多肽分离分析中的应用

　　项目举例

　　纯度分析蛋白测序前样品准备

　　蛋白药物生产过程质量控制

　　杂质或纯度测定

　　结构分析亚基组成分析

　　肽谱分析

　　肽链折叠或构象变化研究

　　二硫键形成，脱氨基等分析

　　结合蛋白研究钙，锌结合蛋白研究

　　抗原－抗体复合物（蛋白－药物，蛋白－ＤＮＡ复合物等）研究

　　生化反应及其过程分析产品定量测定

　　酶催化反应过程监测

　　衍生过程研究或监测

　　生化反应动力学研究

　　蛋白质（ＰＨ，温度，介质）稳定性测定

　　物化常数测定迁移率测定

　　分子量测定

　　等电点测定

　　临床医学血清蛋白分析

　　血红蛋白变异测定

　　脑组织神经肽分离

　　细胞中的蛋白分析

　　同工酶测定

　　微量制备纯化测序用肽样品

　　纯化氨基酸组成分析用的肽或蛋白

　　纯化薄层凝胶制备样品

　　制备质谱测定用样

　　基本概念

　　1.蛋白质的吸附与控制

　　毛细管电泳中的蛋白质吸附，可源于疏水作用、静电作用和其他多种两相分配机制。通常情况下碱性蛋白的静电吸附最为突出。目前，有三类抑制蛋白分子吸附的策略：样品处理、缓冲液改性和管壁惰化处理等。蛋白质的毛细管电泳需要亲水性涂层。

　　典型的样品处理方法是使用变性剂SDS.当SDS单体浓度>１mmol/L时，平均酶克蛋白可结合1.4gSDS.样品处理技术应和添加剂技术一起使用以增强效果。

　　缓冲液不仅影响管壁的状态，而且改变样品的性状，可以看成是样品处理和管壁涂层两种方法的结合。最简单的缓冲液抑制吸附技术是采用极端pH,即令缓冲液的pH远高于或低于样品的pI。多数情况下蛋白质在酸性条件下分离效率和速度要低于碱性条件。除了pH，还可以采用添加剂技术和溶剂变换技术。缓冲液的高浓度无机离子比如0.25mol/LK2SO4,可以和蛋白质竞争吸附位点，从而克服或抑制样品的吸附。疏水蛋白通常难以得到好的分离，此时可以考虑使用非离子型表面活性剂（如Brij35,Tween20,TritonX-100等）为添加剂。

　　溶剂技术也属于添加剂技术。一般地，为了消除某些蛋白的疏水吸附作用，可以考虑采用有机溶剂或有机／水混合剂来配置缓冲液。

　　２.蛋白质的尺寸分离

　　蛋白质的尺寸分离或分子量测定，是化学等研究中的重要工作，通常利用超速离心、质谱、凝胶排斥色谱、SDS-PAGE等方法完成。利用毛细管电泳有较其他方法的优点：

　　１.只需消耗纳升级的样品；

　　２.可在短时间内进行重复和自动化的测定，大大减轻了Ｆerguson法的劳动强度；

　　３.如果能获得准确的分子量标准，可以比较准确的测定未知蛋白质的分子量；

　　４.利用紫外等进行柱上检测，可以实现定量分析等；

　　蛋白质尺寸分析的关键，首先是筛分介质的选择，其次是缓冲体系的确定，此外还需需要仔细考虑进样、分离电压和电泳温度等因素。

　　３.蛋白质等点聚焦

　　等点聚焦最句特色的应用是测定位置蛋白的等电点。CIEF的核心是如何进行聚焦以及如何对区带进行检测。将分离区带推过检测窗口是常用的检测方法，根据驱动带经过检测系统原理和方法的不同，可将CIEF分为两步法和一步法。

　　４.蛋白质的亲和毛细管电泳

　　亲和毛细管电泳，可以用于研究诸如抗原－抗体或配体－受体等特异性相互作用。本法可研究多配体的竞争或协同作用，只需要微量的受体材料，比平衡测定法或光谱测定技术简单而且更快速、更精确。