凝胶渗透色谱净化、气相色谱、质谱法同时测定金银花中33种农药残留组分

【摘要】 　　建立了凝胶渗透色谱（GPC）净化、气相色谱质谱（GCMS）同时测定金银花中33种有机氯、有机磷和拟除虫菊酯农药残留的方法。样品中的待测农药组分经乙酸乙酯环己烷混合溶剂（1∶1， V/V）提取、GPC净化去除色素等杂质，GCMS采用全扫描/选择离子监测模式（Scan/SIM）采集数据后进行定性/定量分析。方法的相对标准偏差（RSD）≤16.70 %（6.9～84.6 ng/g，n=5）；5种不同加标浓度下，待测农药的标准加入回收率在57.4%（甲胺磷）～109.9%（马拉硫磷）之间；各农药组分的定性检出限（3σ）为0.10～10.5 ng/g，定量检出限（10 σ）为0.33～20.0 ng/g。

【关键词】  金银花； 凝胶渗透色谱； 气相色谱质谱； 农药残留

　　1  引  言

    中药安全问题，如中药中的有害成分[1]、重金属污染[2,3]、农药残留[4,5]等已引起广泛关注[6,7]。有关中药中农药残留测定方法的研究已有许多报道[4,5,8～10]，但涉及的农药品种较单一，多数仅局限于2000年“中国药典”规定的六六六、滴滴涕和五氯硝基苯，同时测定中药中有机氯、有机磷和拟除虫菊酯农药的方法尚未见报道。
   
　　已报道的中药中农药残留检测方法中，多数采用固相萃取（SPE）净化和气相色谱（GC）测定[11～13]。与传统的SPE相比，凝胶渗透色谱（GPC）净化具有自动化程度高、重现性好等优点，适合于中药材、生物等复杂基质中农药残留测定的净化过程。气相色谱质谱（GCMS）不仅能准确定量，而且能定性确证目标组分［１４］，避免了GC测定造成的误判和假阳性结果。

    金银花为传统中草药，具有清热解毒功效，用量多，用途广，严格控制农药残留量显得尤为重要[1３]。本研究结合凝胶渗透色谱和气相色谱质谱技术，建立了同时测定中药材金银花中33种有机氯、有机磷和拟除虫菊酯农药残留的方法。GPC将待测目标农药与样品基质中的大分子物质（如色素等）分离[1４～1７]，达到分离、净化农药组分的目的；GCMS则根据保留时间和特征离子丰度比进行双重定性，避免误判，SIM模式提高测定的灵敏度和选择性，达到准确定量的目的。

　　2  实验部分

　　2.1  仪器与试剂

    7890A5975C 气相色谱质谱联用仪（美国Agilent公司）， 配备自动进样器和化学工作站； LC Tech全自动凝胶渗透色谱仪， Bio Beads SX3凝胶净化柱（40 0mm×25 mm×(38～75) μm）； EVAⅢ自动浓缩仪（德国LC公司）； B5200SOT超声波清洗仪（美国Branson公司）； MS2微型旋涡混匀器（德国IKA公司）； 04121离心机（上海手术器械厂）；实验室自制氮吹浓缩装置。
   
　　丙酮、乙酸乙酯和环己烷(色谱纯, 美国Fisher公司）; 33种农药标准(购于国家标准物质研究中心)。

　　2.2  样品预处理

    将金银花样品磨碎，过孔径380 μm的筛后准确称取1.0000 g于15 mL聚乙烯离心管中，加入5 mL乙酸乙酯环己烷（1∶1， V/V）混合提取剂，混匀，超声波提取10 min后， 3000 r/min离心3 min，取上清液；重复上述操作两次，合并3次提取液，氮吹浓缩至10 mL；0.2 μm滤膜过滤后取5 mL通过GPC进行净化，乙酸乙酯环己烷（1∶1， V/V）为流动相，流速5 mL/min，收集17～36 min流出物95 mL，用EVA Ⅲ自动浓缩仪浓缩至5 mL，乙酸乙酯环己烷（1∶1， V/V）定容至0.5 mL，供GCMS测定。

　　2.3  色谱质谱条件

    DB5 ms毛细管柱（30 m×250 μm， 0.25 μm），载气为高纯氦气（纯度≥99.999%）；进样口温度250 ℃，恒压模式，不分流进样，进样量1μL；以甲基毒死蜱作保留时间锁定。色谱柱初始温度50℃，保持1 min，以25 ℃/min升至125 ℃，再以10 ℃/min升至300℃，保持10 min。

　　电子轰击源（EI），70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；接口温度280 ℃；溶剂延迟3.5 min； 测定模式为全扫描/选择离子监测（Scan/SIM）同时采集模式，表1为SIM模式下的离子分组。表1  SIM离子分组（略）

　　3   结果与讨论

　　3.1  多种农药的定性分析

    各目标农药的保留时间、特征离子及其相对丰度列于表2。TIon， Q1， Q2和Q3为各农药对应的特征离子，其中TIon为定量离子，R1，R2和R3分别为特征离子Q1， Q2和Q3与定量离子TIon的丰度比值，即特征离子Q1， Q2和Q3的相对丰度。图1为33种农药混合标准的总离子流图（TIC）。实验中首先通过保留时间对样品中33种农药残留进行定性，表2(The peak number is the same as in Table 2).再通过比对样品中各农药特征离子的相对丰度与标准溶液中对应农药特征离子的相对丰度，对目标农药进行进一步确证。

　　3.2  提取和净化条件的优化

    在金银花样品基质中，加入适量的33种农药混合标准溶液，振荡混匀后在－4 ℃冰箱中放置4 h，按2.2和2.3节的操作流程进行样品处理及测定。比较乙腈、乙酸乙酯和不同比例的乙酸乙酯环己烷（3∶1和1∶1，V/V）：各农药的预计保留时间(Expectant retention time for pesticides)。的提取效果。实验结果表明，乙酸乙酯环己烷（1∶1， V/V）不仅能有效地提取33种农药，同时也减小了基质共提取物对目标农药定性/定量测定的干扰。此外，乙酸乙酯环己烷（1∶1， V/V）与GPC流动相一致，因而选择乙酸乙酯环己烷（1∶1， V/V）为农药目标物的提取剂。表2  33种农药的保留时间、特征离子及其相对丰度（略）
   
　　通过分时段收集GPC的流出物，发现33种农药主要在16～36 min流出，但16～17 min的流出物仍含有较多色素。为避免色素对目标物测定的干扰，最终选取17～36 min为流分收集时间。实验结果表明： 17～36 min之间的流出物既能保证各农药有较高的回收率，又可避免色素等杂质的干扰，可达到待测组分GPC净化的目的。

　　3.3  方法精密度

    以人工合成样品进行方法精密度实验。准确称取5份各1.0000 g金银花样品，分别加入相同量的农药混合标准溶液，振荡混合均匀后在－4 ℃冰箱中放置4 h，制备成含适量农药的人工合成样品；然后按照2.2和2.3节进行目标物提取、净化和测定。33种农药在添加标准浓度在6.9（毒虫畏E）～84 ng/g（毒虫畏Ｚ）范围内的相对标准偏差为5.9%（马拉硫磷）～14%（氯氰菊酯）范围内，各种农药的添加标准浓度，测得的标准偏差、相对标准偏差和定量检测下限详见附表(http://www.analchem.cn/table/090832.pdf)。结果表明，在较低添加浓度水平时，各农药组分测定的相对标准偏差小于16.7%。

　　3.4  方法的准确度

    以标准加入回收实验的回收率来验证方法的准确度。准确称取5份各1.0000 g金银花样品，分别在5份样品中加入表4所列浓度的农药混合标准溶液，振荡混合均匀后在－4 ℃冰箱中放置4 h，制备成含适量农药的人工合成样品；然后按照2.2和2.3节进行目标物提取、净化和测定，计算各组分的回收率。以各农药组分的定量离子峰面积对添加农药标准浓度作图，用线性回归的方法对测得的峰面积和标准加入农药浓度进行回归，求得线性回归方程和相关系数。表３列出了33种农药在5个不同加标浓度下的回收率、线性回归方程和相关系数。

    结果显示，5种不同加标浓度下，除甲胺磷（57.4%）和敌敌畏（66.0%）外，其它待测农药的标准加入回收率在72.3%（六氯苯）～109.9%（马拉硫磷）之间，线性相关系数r≥0.9855，说明本方法在各组分所添加的浓度范围内，各组分的回收率是稳定的。表３  33种农药的加标加入回收结果（略）

　　3.5  方法检出限

    以3倍信噪比(S/N)计算33种农药的定性检出限（LOD）, 10倍信噪比计算定量检出限（LOQ）。33种农药的检出限列于表3。33种农药的定性检出限为0.10～10.5 ng/g，定量检出限为0.33～20.0 ng/g。 结果表明，本方法自动化程度高、选择性较好、检出限低，具有稳定的回收率和较小的相对标准偏差，可满足典型中药金银花中多种农药残留测定的要求。

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