司帕沙星含量的HPLC测定

摘　要：司帕沙星是一类喹诺酮类抗菌药物，该文采用反相高效液相色谱法对其生产进行质控分析，测定中选用C18柱，以甲醇－水(内含40mmol^.L^－1的磷酸二氢钾和30mmol^.L^－1的四乙基溴化铵,V_甲醇∶V_水=45∶55）为流动相，于298nm进行检测，样品测定的回收率为97.9％～100.2％,相对标准偏差不大于2％。

Determination of Sparfloxacin by High-performance Liquid Chromatography

SUN Yu-an　WANG Guo-qing
（Department of Chemical Engineering, Zhengzhou Institute of Light Industry, Zhengzhou 450002, China）
CUI Quan-zhong
（Zhengzhou Chemical Pharmaceutical Ltd, Zhengzhou 450000, China）

Abstract：Sparfloxacin is a kind of quinoline antimicrobials. A method for its determination by reversed-phase high-performance liquid chromatography with C18 chromatographic column, methanol－water solution(containing 40 mmol^.L^－1 KH2PO4 and 30 mmol^.L^－1 tetraethyl ammonium bromide，Vmethanol∶Vwater=45∶55) as the mobile phase and UV detector at 298 nm is reported. The recovery is 97.9％～100.2％, and the relative standard deviation is less than 2％.
Keywords：Sparfloxacin; Antimicrobial; Determination; High performance liquid chromatography

　　司帕沙星(Sparfloxacin)化学名为5-amino-1-cyclopropyl-6,8-difluoro-1,4-dihydro-7-
(cis-3,5-dimethyl-1-piperazidine)-4-oxoquinoline-3-carboxylicacid即5－氨基－1－环丙基
－6,8－二氟－1,4二氢－7－(顺3,5－二甲基－1－哌嗪基)－4－氧代喹啉－3－羧酸,是“第四代”喹诺酮类药物,它对革兰氏阴性需氧菌和革兰氏阳性厌氧菌抗菌活性增强，对支原体、衣原体、结核分支杆菌的抗菌活性是已上市的品种中最强者。对喹诺酮类抗菌药物的研究一直是国际上比较活跃的研究领域，在欧美等药物合成较发达的地区经常有专利文献报道^[1～3]。无论理论和临床使用情况都证实司帕沙星为一种广谱、高效的抗菌药物。文献^[1]中给出了部分喹诺酮类样品的基本提纯方法，给出了利用高效液相色谱法测定的纯度等，但并未给出具体的色谱条件。目前我们尚未见到公开的对司帕沙星的生产过程进行过程控制分析的文献报道。
　　本文用高效液相色谱法对司帕沙星进行质控研究,可用于生产原料、合成过程以及成品制剂的标准分析,结果令人满意。

1实验部分

1.1仪器与试剂
　　HP1090MHPLC高效液相色谱仪；HP1047A二极管阵列UV检测器；甲醇(色谱级)经0.45μm有机滤膜过滤;水(蒸馏水)经0.45μm水系滤膜过滤;四乙基溴化铵(分析纯);司帕沙星对照品(实验室合成样品经提纯而得，纯度为99.6％)。
1.2色谱条件
　　色谱柱:μ－BandparkC18柱(ID3.9mm×300mm，10μm);流动相:A液为40mmol^.L^-1KH2PO4＋30mmol^.L^-1四乙基溴化铵水溶液,B液为甲醇,V_A∶V_B=55∶45；流速:1.1mL/min;检测波长:298nm,带宽4nm;参比波长:450nm,带宽50nm。

2结果与讨论

2.1样品处理
2.1.1司帕沙星成品的处理准确称取司帕沙星成品20mg于100mL容量瓶中,用甲醇溶解（超声波处理），稀释至刻度,摇匀,过滤。
2.1.2合成过程样液处理移取合成各阶段的样液1mL置于100mL的容量瓶中,加甲醇溶解（超声波处理）并稀释至刻度,摇匀,过滤。
2.2测定方法
2.2.1标准溶液的配制准确称取对照品司帕沙星10、20、30、40、50、60mg分别置于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度,摇匀,进样10μL。按1.2所述色谱条件进样得色谱图,以峰面积Y与司帕沙星质量浓度X(mg/L)进行回归分析得直线方程Y=410X＋0.00,r=0.9998。
2.2.2检测波长的选择在二极管阵列检测器上对司帕沙星进行扫描,确定它的测定波长为298nm,其UV光谱图见图1。

图1 司帕沙星的UV光谱图
Fig.1 UV spectrogram of Sparfloxacin

2.2.3流动相的选择只用甲醇、水、乙腈作流动相对司帕沙星进行测定时，由于司帕沙星中有羧基和氨基，色谱峰拖尾较严重,通过加入KH₂PO₄和四乙基溴化铵,调节流动相的pH值,分析时采用甲醇－水(内含40mmol^.L^-1的磷酸二氢钾和30mmol^.L^-1的四乙基溴化铵，V_甲醇∶V_水=45∶55）为流动相，于298nm进行检测得到较好的分离效果,见图2。

图2 样品分离色谱图
Fig.2 Chromatogram of sample

2.3回收率试验
　　取空白辅料,精密加入司帕沙星适量,置于50mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释到刻度,摇匀,过滤,取过滤液5.0mL于50mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,按1.2色谱条件进行测定,计算得平均回收率在97.1％～100.2％之间(见表1),说明方法可靠。

表1 回收率试验结果
Table 1 Results of recovery test

Added Sparfloxacin
m_A／mg

Found
m_F／mg

Recovery
R／％

14.20

13.90

97.9

19.10

18.99

98.4

25.29

25.35

100.2

14.07

14.01

99.6

19.45

19.27

99.1

2.4精密度试验
　　以960153样品为例,平行测定6次,计算得其相对标准偏差（RSD）为1.7％。
2.5合成中间体的分析
　　取成品前三步合成反应中间体制成混合样品,按1.2所给色谱条件进行测定，能较好地分出4个峰,见图3,其中保留时间3.55min的色谱峰2为司帕沙星的谱峰,用中间体对照混合样品,可确定另外3个峰为成品前三步合成中间体。

图3 相关物质色谱图
Fig.3 Chromatogram of relative materials
1.1－环丙基－5,6,7,8－四氟－1,4－二氢－4－氧代喹啉－3－羧酸(1-cyclopropyl-5,6,7,8-tetrafluoro-1,4-dihydro-4-oxoquinoline-3-carboxylic acid); 2.司帕沙星(Sparfloxacin) 3. 哌嗪(piperazidine); 4.1－环丙基－5,6,7,8－四氟－1,4－二氢－4－氧代喹啉－3－羧酸乙酯(1-cyclopropyl-5,6,7,8-tetrafluoro-1,4-dihydro-4-oxoquinoline-3-carboxylic acid ethyl ester)

3结论

　　本法不仅可用内标法测定制剂的含量,还可用面积归一化方法测定原料的纯度。原料中仅有极少数保留时间为3.1min的中间体峰1,没有保留时间为6min和10.2min的中间体峰3、4和其它杂质。本法还可用于在司帕沙星的合成工艺过程中,对其合成提供一些有用的参数,对改进工艺条件有很大的益处。
　　本文所拟定的分析方法简便,快速,对成品分析时色谱分离过程仅需6min。

作者简介：孙雨安(1964－), 男, 河南郑州人, 讲师.
作者单位：孙雨安（郑州轻工业学院化学工程系，河南郑州450002）
　　　　　王国庆（郑州轻工业学院化学工程系，河南郑州450002）
　　　　　崔泉中（郑州化学药业有限公司，河南郑州450000）

参考文献：

[1] WEMPLE J N. Improved process for the preparation of 5-amino-7-(substituted amino)-quinoline-3-carboxylic acids[P]. European Patent Appliation: 0342649A2, 1989－05－17.
[2] IKOMA J M, SAKAI T M, TOYONAKA H E, et al. 5-Substituted-6,8-difluoroquinolines useful as antibacterial agents[P]. United States Patent: 4795751, 1989－01－03.
[3] LANGDON W K, ILE G, LEVIS W W, Jr, et al. Synthesis of 2,6－dialkylpiperazines[P]. United States Patent Office: 2911407,1959－11－03.

收稿日期：1999－05－06