他唑巴坦及其制剂注射用哌拉西林钠/他唑巴坦钠的HPLC含量测定方法的建立

摘要目的：建立他唑巴坦及其制剂注射用哌拉西林钠/他唑巴坦钠的HPLC含量测定方法。
方法：他唑巴坦的HPLC含量测定色谱条件：C₁₈柱，流动相：pH4.0的乙腈-0.05mol^.L^-1的磷酸二氢钾水溶液-2.5mmol^.L^-1四丁基氢氧化铵(180∶805∶15)，检测波长为230nm，流速：1 mL^.min^-1；注射用哌拉西林钠/他唑巴坦钠的HPLC含量测定色谱条件：C₁₈柱，流动相为pH3.5的甲醇-水-2.5mmol^.L^-1四丁基氢氧化铵(450∶535∶15)，检测波长为230nm，流速：1mL^.min^-1。
结果：他唑巴坦的HPLC含量测定方法的线性范围为0.1～3.2mg^.mL^-1，日内RSD为0.3%，日间RSD为0.42%～0.65%；注射用哌拉西林钠/他唑巴坦钠的HPLC含量测定方法中，他唑巴坦的线性范围为0.05～1.0mg^.mL^-1，日内RSD为1.1%，日间RSD为1.1%～1.5%，哌拉西林的线性范围为0.4～1.6 mg^.mL^-1，日内RSD为0.35%，日间RSD为0.27%～0.46%。
结论：本法简便，快速，准确可靠。

The Establishment of Method for the Determination
of Tazobactam and Tazocin(Piperacillin Sodium
and Tazobactam Sodium for Injection)

Yuan Yaozuo,Hu Changqin and Jin Shaohong
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050)

AbstractObjective：A HPLC method for determination of tazobactam and its preparation piperacillin sodium and tazobactam sodium for injection was developed.
Methods:The HPLC method for determination of tazobactam was:C₁₈ column,mobile phase:pH 4.0 acetonitrile-0.05 mol^.L^-1 potassium dihydrogen phosphate-2.5 m mol^.L^-1 tetrabutylammonium hydroxide (180∶805∶15),detector wavelength:230 nm,flow rate:1 mL^.min^-1;the HPLC method for determination of piperacillin sodium and tazobactam sodium for injection was:C₁₈ column,mobile phase:pH 3.5 methanol-H₂O-2.5 m mol^.L^-1 tetrabutylammonium hydroxide (450∶535∶15),detector wavelength:230 nm,flow rate:1 mL^.min^-1.
Results:The linear range is 0.1～3.2 mg^.mL^-1，RSD within day is 0.3%,RSD between days is 0.42%～0.65%;about the HPLC method for determination of tazobactam and both the linear ranges of piperacillin and tazobactam are 0.4～1.6 mg^.mL^-1 and 0.05～1.0 mg^.mL^-1,RSD of tazobactam within day is 1.1%，and RSD of tazobactam between days is 1.1%～1.5%;RSD of piperacillin within day is 0.35%,and RSD of piperacillin between days is 0.27%～0.46% about the HPLC method for determination of the preparation.
Conclusion:Those methods are simple,rapid and reliable.
Key words　HPLC，tazobactam,piperacillin sodium and tazobactam sodium for injection

　　他唑巴坦是继克拉维酸、舒巴坦之后的又一β-内酰胺酶抑制剂，其稳定性好，抑酶活性强，可与多种抗生素联用，既能增强后者的抗菌活性，又可以扩大其抗菌谱^［1］。参照有关文献［2，3］，建立了他唑巴坦及其制剂注射用哌拉西林钠/他唑巴坦钠的HPLC含量测定方法。

1　仪器与试剂
Waters 510泵，Waters 486紫外检测器，Milleninm 2010色谱工作站。
他唑巴坦、注射用哌拉西林钠/他唑巴坦钠由深圳海滨制药厂提供，他唑巴坦、哌拉西林对照品由中国药品生物制品检定所抗生素室提供，其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

2　他唑巴坦的含量测定方法的建立
2.1　实验条件　
色谱柱：SpherisorbC₁₈柱(100mm×4.6mm，5μm)，流动相为pH4.0的乙腈-0.05 mol^.L^-1的磷酸二氢钾水溶液-2.5mmol^.L^-1四丁基氢氧化铵(180∶805∶15)。先将0.05mol^.L^-1磷酸二氢钾水溶液与2.5mmol^.L^-1四丁基氢氧化铵按比例混合，用50%的磷酸调节pH至4.0，再加入一定量的乙腈，脱气，备用。检测波长：230nm，流速：1mL^.min^-1。
2.2　供试溶液的配制与测定　
精密称取他唑巴坦及其对照品约25mg于25mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，分别吸取上述溶液20μL注入液相色谱仪中，用外标法进行计算。色谱图见图1。
2.3　结果与讨论
2.3.1　流动相中四丁基氢氧化铵浓度对色谱分离的影响　
以pH4.0的乙腈-0.05mol^.L^-1的磷酸二氢钾水溶液-四丁基氢氧化铵(180∶805∶15)为流动相，改变流动相中四丁基氢氧化铵浓度，考察其对他唑巴坦的主要色谱行为的影响。结果(表1)表明，如果流动相中不加入四丁基氢氧化铵，他唑巴坦与相邻组分不能有效地分离，加入反离子后，即使在浓度很低的情况下，也能明显改善分离效果。分离度随四丁基氢氧化铵浓度的增加而有所增加，保留时间也有所增大，提示在水溶液中他唑巴坦能够与四丁基氢氧化铵结合形成离子对，减小了整个分子的极性，增加了样品在色谱柱上的保留能力，在保证相邻组分有效分离的情况下，为提高分析速度，四丁基氢氧化铵浓度采用2.5mmol^.L^-1。

图1　他唑巴坦的色谱图
1.他唑巴坦

表1　四丁基氢氧化铵的浓度对色谱分离的影响

浓度/
m mol^.L^-1

主峰保留时间/
min

分离度
(主峰与邻峰)

0.0

7.15

0.81

2.5

9.23

1.68

5.0

9.76

1.73

10.0

10.02

1.81

20.0

10.46

1.85

2.3.2　流动相的pH对色谱分离的影响　
以乙腈-0.05mol^.L^-1的磷酸二氢钾水溶液-2.5mmol^.L^-1四丁基氢氧化铵(180∶805∶15)为流动相，改变其pH，考察pH对他唑巴坦的色谱行为的影响。结果(表2)表明，流动相的pH愈小，他唑巴坦在色谱柱中的保留时间愈长，分离效果越好。当pH小于5.0，分离度均大于1.5，提示在偏酸性条件下他唑巴坦在水溶液中可能主要以极性较小的分子形式存在，当流动相的pH增大，他唑巴坦分子有所解离，以离子的形式出现，极性增加，保留减小。故要想提高系统的选择性，应尽量使流动相的pH降低，考虑到ODS色谱柱的pH使用范围在2.0～7.0，故该流动相的pH选用pH 4.0。

表2　pH对色谱分离的影响

pH

主峰保留时间/
min

分离度
(主峰与邻峰)

3.0

10.41

2.10

4.1

10.39

1.62

5.0

9.29

1.51

5.9

8.87

1.34

7.0

6.91

1.21

2.3.3　流动相中缓冲液浓度对色谱分离的影响　
流动相的其他条件不变，只改变流动相中磷酸二氢钾浓度，考察他唑巴坦的色谱行为的变化。结果(表3)提示，流动相的离子强度影响他唑巴坦的色谱行为。随着浓度增大，分离度减小，保留时间增大，表明流动相的盐浓度偏低对色谱分离有利，但缓冲液浓度的降低可能引起流动相pH不稳定，影响分析系统的重现性，因而又希望增加流动相的缓冲液的浓度，综合2种因素，流动相中磷酸二氢钾浓度用0.05mol^.L^-1。

表3　磷酸二氢钾浓度对色谱分离的影响

浓度/
mol^.L^-1

主峰保留时间
/min

分离度
(主峰与邻峰)

0.0

12.4

2.3

0.0125

11.2

2.2

0.025

10.9

1.8

0.050

9.3

1.6

0.100

7.4

1.5

2.3.4　流动相中乙腈浓度对色谱分离的影响　
流动相的其他条件不变，只改变流动相的乙腈浓度，考察他唑巴坦的色谱行为的变化。结果(表4)表明，乙腈浓度增大，他唑巴坦保留时间明显减小，分离度也在减小。兼顾色谱的有效分离和分析速度的提高，流动相的乙腈浓度采用18%较为合适。

表4　乙腈浓度对色谱分离的影响

浓度/%

主峰保留时间/
min

分离度
(主峰与邻峰)

15

15.1

2.3

18

10.7

1.8

20

9.6

1.5

22

8.4

1.4

25

7.0

1.0

2.4　色谱系统的专属性　
在上述色谱系统中对他唑巴坦经60℃高温放置10d的样品进行测定，见图2。并用光电二级管阵列紫外检测器对常规样品的色谱峰进行检查，见图3。结果表明该色谱系统中他唑巴坦的主组分峰为单一峰，本系统能够将样品中的杂质与主组分有效地分离。

图2　他唑巴坦经60℃高温放置10d的样品色谱图
1.他唑巴坦高温主要降解物　2.他唑巴坦

2.5　标准曲线的制备　
精密称取他唑巴坦对照品，用一定量的甲醇溶解，用水定容，使成0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mg^.mL^-1的溶液，在上述色谱条件下进样20μL，以浓度对峰面积作图，得回归方程：

A=854931.1C+4452.5　r=0.9999

2.6　精密度　
在上述色谱条件下，在同一天内对同一样品进行5次测定，日内RSD为0.3%。

图3　光电二极管阵列紫外检测器的三维色谱图
1.他唑巴坦

2.7　重现性　
取3个不同批号的样品，在上述色谱条件下分别在3d测定含量，日间的RSD分别为0.65%、0.42%、0.48%,n=3。
2.8　样品溶液的稳定性　
取他唑巴坦样品制成1mg^.mL^-1的溶液，在上述色谱条件下测定其相对与0.0h的百分含量(假定0.0h溶液的含量为100%)，测定不同时间下溶液的浓度变化(每隔0.5h进样)，5h内测定的10次结果的RSD为0.52%，结果表明他唑巴坦在溶液中稳定。

3　注射用哌拉西林钠/他唑巴坦钠的HPLC含量测定方法的建立
3.1　实验条件　
色谱柱：SpherisorbC₁₈柱(100mm×4.6mm，5μm)，流动相：pH3.5的甲醇-水-2.5mmol^.L^-1四丁基氢氧化铵(450∶535∶15)。先将水与2.5mmol^.L^-1四丁基氢氧化铵按比例混合，用50%的磷酸调节pH至3.5，再加入一定量的甲醇，进行脱气，备用，检测波长：230nm，流速：1mL^.min^-1。
3.2　供试品溶液的配制与测定　
精密称取他唑巴坦对照品约10mg、哌拉西林对照品约80mg于100mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，另精密称取注射用哌拉西林钠/他唑巴坦钠约50mg于50mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为供试品溶液。分别吸取上述溶液各20μL注入液相色谱仪中，用外标法进行计算，色谱图见图4。

图4　注射用哌拉西林钠/他唑巴坦钠的色谱图
1.他唑巴坦　2.哌拉西林

3.3　结果与讨论　
与他唑巴坦原料不同的是，注射用哌拉西林钠/他唑巴坦钠需要分别测定他唑巴坦和哌拉西林2个组分。由于哌拉西林有较大的侧链，它的脂溶性远远大于他唑巴坦，文献报道中对注射用他唑巴坦钠/哌拉西林钠两组分的含量测定采用梯度洗脱法，这种方法对仪器的要求高，而且费时间，操作复杂。在参考了他唑巴坦及哌拉西林原料^［3］含量测定的HPLC条件，并综合考虑他唑巴坦与哌拉西林的理化特性，通过实验考察流动相的pH、盐的浓度、有机溶剂浓度的改变对两组分色谱行为的不同影响，建立了其HPLC等度洗脱的含量测定方法。
3.3.1　流动相中缓冲液浓度的影响　
磷酸盐浓度增加能够减小他唑巴坦的分离度和保留时间，但对哌拉西林的色谱行为影响不大，所以，希望其浓度越小越好，故流动相中没有采用磷酸二氢钾水溶液而直接以水来代替。
3.3.2　同哌拉西林的HPLC色谱条件比较^［3］　
流动相中反离子由原来的四乙基氢氧化铵改用四丁基氢氧化铵，因为用四乙基氢氧化铵作为该色谱系统的反离子尽管不影响哌拉西林的分析效果，但在此条件下，他唑巴坦与其相邻组分很难分开，但采用一定浓度的四丁基氢氧化胺就可以让两者均达到满意的结果。
3.4　色谱系统的专属性　
在上述色谱系统中对注射用哌拉西林钠/他唑巴坦钠经60℃高温放置10 d的样品进行测定，见图5。并用光电二级管阵列紫外检测器对他唑巴坦与哌拉西林按1∶1的摩尔比配制的样品的色谱峰进行检查，见图6。结果表明该色谱系统中他唑巴坦与哌拉西林的主组分峰均为单一峰，本系统能够将样品中的杂质与主组分有效地分离。

图5　注射用哌拉西林钠/他唑巴坦钠经60℃高温放置10d的样品色谱图
1.他唑巴坦　2.哌拉西林

图6　光电二级管阵列紫外检测器的三维色谱图
1.他唑巴坦　2.哌拉西林

3.5　标准曲线的制备
3.5.1　他唑巴坦的标准曲线的制备　
精密称取他唑巴坦对照品，用一定量的甲醇溶解，用水定容，使成0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、1.0mg^.mL^-1的溶液，在上述色谱条件下进样20μL，以浓度对峰面积作图，得回归方程：

A=10253764C-55360.7　r=0.9998

3.5.2　哌拉西林的标准曲线的制备　
精密称取哌拉西林对照品，用一定量的甲醇溶解，用水定容，使成0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mg^.mL^-1的溶液，在上述色谱条件下进样20μL，以浓度对峰面积作图，得回归方程：

A=29147898.1C-102698.1　r=0.9997

3.6　精密度　
在上述色谱条件下，对同一注射用哌拉西林钠/他唑巴坦钠的样品进行5次测定，哌拉西林钠日内RSD为0.35%,他唑巴坦日内RSD为1.1%。
3.7　重现性　
取3个批号的样品，在上述色谱条件下进行操作，分别在3 d测定含量，哌拉西林钠日间RSD分别为0.32%、0.46%、0.27%，他唑巴坦日间RSD分别为1.5%、1.1%、1.4%，n=3。
3.8　回收率　
用已知含量的哌拉西林钠和他唑巴坦按6∶1、8∶1、10∶1的比例进行混合，在上述色谱条件中测定回收率，结果表明，该方法他唑巴坦的平均回收率为99.8%(n=3)，RSD为1.2%，哌拉西林的平均回收率为99.5%(n=3)，RSD为1.5%。

4　小结
本文建立的他唑巴坦及其制剂注射用哌拉西林钠/他唑巴坦钠的HPLC含量测定方法简便，快速，有较好的准确性和良好的重现性，尤其是注射用哌拉西林钠/他唑巴坦钠的HPLC含量测定方法，能够将2个极性相差较大的组分在普通的色谱条件下，在15min左右测定出来，大大地节省了分析时间。

作者单位：胡昌勤 金少鸿　中国药品生物制品检定所 北京100050
袁耀佐　现在江苏省药品检验所

参考文献
1　朱汝锦.新酶抑制剂Tazobactam的特性及其与哌拉西林的复合制剂.国外医药抗生素分册，1995，16(5)：187
2　Teruyoshi Marunaka,Madoka Maniwa,Yoshinori Minami.High-performance liquid chromatorgraphic determination of a new β-lactamase inhibitor and its metabolite in combination therapy with piperacillin in biological materials.J Chromatogr,1988,431:87
3　中国药典.1995.二部：468

收稿日期:1999-05-14