HPLC法测定银杏叶中3种内酯成分

(中国医学科学院协和医科大学药物研究所　北京　100050)

摘要　　研究了用反相高效液相色谱法测定银杏叶及其提取物中3种银杏内酯含量的方法，采用外标法定量。色谱柱：Zorbax ODS柱，流动相：甲醇—四氢呋喃—水(1∶1∶8)，流速：1.0 mL/min，检测波长：220 nm，线性范围：2.008～33.41 μg，r＝0.999～0.9999，回收率：92.7 %～100.9 %。本法结果准确，重现性好，为生产及工艺研究提供质量控制依据。
关键词：银杏　银杏内酯　反相高效液相色谱法
银杏(Ginkgo biloba L.)又名公孙树，是最古老的植物之一。故有裸子植物活化石之称。据《本草纲目》记载，银杏果具有敛肺平喘、止遗尿、白带的作用^［1］。现代药理研究表明，银杏内酯成分除具有扩张冠状动脉血管、增加脑血流量、改善脑营养及抗菌作用外，还有较强的血小板活化因子(PAF)抑制作用^［2，3］，因此具有较高的研究和开发价值。HPLC法测定银杏叶提取物中的银杏内酯成分已有文献报道^［4～6］，但对银杏叶中内酯成分直接测定的方法尚未见报道。本法采用反相HPLC法对银杏叶中3种内酯成分Ginkgolide A(GA)、Ginkgolide B(GB)、Ginkgolide C(GC)的含量进行了测定，考察了生药中3种内酯的提取、分离及测定条件。本法可用于银杏叶及其提取物的分析。
1　仪器、药品
仪器：高效液相色谱仪由510型恒流泵(Waters)、紫外检测器SPD—2A型(Shimadzu)、7125型进样阀(Rheodyne)及数据处理机C—R6A(Shimadzu)组成。
对照品：GA、GB、GC皆由作者从银杏叶中提取、分离获得。经HPLC检查未见杂质峰。
样品：银杏叶自采，银杏叶提取物由徐州某药厂提供。试剂：AR级。
2　色谱条件
色谱柱：Zorbax ODS柱(150 mm×4 mm，5 μm)；流动相：甲醇-四氢呋喃-水(1∶1∶8)；流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm；柱温25 ℃。
3　测定条件
3.1　流动相的选择　比较了不同比例的甲醇—水、异丙醇—水、乙腈—水、乙腈—四氢呋喃—水、甲醇—四氢呋喃—水等系统，以甲醇—四氢呋喃—水(1∶1∶8)为流动相分离效果好，3种内酯粗提物的HPLC色谱图见图1。

图1　HPLC色谱图
1.GC(12min)　2.GA(21min)　3.GB(31min)

3.2　检测波长的选择　将银杏内酯GA、GB、GC在UV 3000型(岛津)分光光度计上分别进行光谱扫描，3种内酯在220 nm波长处有最大吸收，故选择此波长进行检测。
3.3　线性关系　取3种内酯对照品各约25 mg，精密称定，加甲醇溶解，分别定容为5 mL。吸取各对照品溶液0.4、0.8、1.0、1.2、1.6 mL于5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，按上述色谱条件，进样5 μL，测定峰面积，以峰面积对进样量(μg)进行回归分析，得到3条通过原点的直线，其线性范围及相关系数为GA：2.088～33.41 μg，r＝0.9996；GB：2.008～32.13 μg，r＝0.9999；GC：2.048～20.48 μg，r＝0.9997。
3.4　提取条件　以甲醇、丙酮、乙醚等作为溶剂，按“测定方法”项操作，测定内酯含量，结果表明，甲醇提出杂质较多，对检测有干扰；乙醚对内酯成分的提取率较差，而用丙酮的提取效果好。另取样品以丙酮回流提取1、1.5、2、3 h测定内酯含量，结果表明回流提取2 h已使内酯提取完全。
3.5　回收率及精密度　取等量样品5份，其中3份加入混合对照品溶液(3种内酯各约25 mg，精密称定，溶于5 mL甲醇中)一定量，依法提取、分离及测定，计算GA、GB、GC　的回收率分别为　100.9 %、95.1 %和92.7 %，　RSD分别为1.93 %、2.68 %　、2.85 %(n=3)。取上述对照品混合液，连续进样11次，每次进样5 μL，测得结果RSD分别为GA：1.23 %，GB：2.90 %，GC：1.04 %。
4　测定方法
取银杏叶细粉(60目)20 g，准确称定，装入改良索氏提取器中，加石油醚(30～ 60℃)150 mL，回流1 h，然后改用丙酮150 mL提取2 h。蒸干丙酮提取液，用适量甲醇溶解后上Sephadex LH 20凝胶柱，用甲醇洗脱，接收200～300 mL部分的洗脱液，蒸干后，用甲醇转移至5 mL量瓶中并定容。按上述色谱条件，进样5 μL，进行测定，以外标法计算含量。
5　样品分析
用本法对不同产地的银杏叶测定结果见表1。
6　讨论
6.1　四氢呋喃对银杏内酯的分离起了很好作用，但四氢呋喃的量增加使检测器噪声增大，检测灵敏度降低。

表1　银杏叶中内酯的测定结果(%)

产地

采收时间

GA

GB

GC

总含量

南雄

94.10

0.036

0.037

0.0039

0.078

北京

95.9

0.012

0.022

0.0021

0.036

承德

95.10

0.009

0.009

0.0016

0.020

西安

95.10

0.010

0.020

0.0036

0.034

徐州

94.

0.024

0.022

0.0017

0.048

徐州^*

0.62

1.46

0.25

2.33

*银杏叶提取物

6.2　为了消除杂质对银杏内酯的测定干扰，而采用柱前预处理的方法。用萃取法^［6］仅适用于GB的含量测定，而其它内酯皆为杂质峰掩盖。用聚酰胺柱串联ODS柱的方法^［4］进行预处理，可用于银杏叶提取物中4种内酯(银杏内酯A、B、C和白果内酯)的测定，但不适用于银杏叶中内酯的测定。采用氧化铝柱处理的方法，也仅用于提取物中的内酯测定，而且未给出回收率的结果，我们曾试用活性炭去除杂质，但其回收率很低，然后改用Sephadex柱处理方法，效果很好。
6.3　由于银杏内酯在紫外光区吸收小，检测灵敏度低，曾试用示差折光检测法，结果表明周围环境(如温度)的影响较大，基线不易平，而且检测灵敏度亦较紫外检测法差。
6.4　不同产地的银杏叶3种内酯的测定结果表明GC的含量最低，银杏内酯含量差异较大，有人认为亚热带地区的银杏叶中内酯含量比北温带地区高，分析结果初步证实了这种观点。在测定结果中，3种内酯含量最高的是广东南雄，其次是江苏徐州，而河北承德产的银杏叶的内酯含量最低。

参考文献
1　　中国医学科学院药物研究所等编.中药志，第三册.北京：人民卫生出版社，1984.296
2　　Van Beek T A,et al.Concentration of Ginkgolides and Bilobalide in Ginkgo biloba leaves in relation to the time of the year.Plana Medica,1992,58:413
3　　Sticher O,et al.Ginkgo biloba Eine Standortbestimmung,Dtsch Apoth Ztg,1991,131:1827
4　　Van Beek T A,et al.Determination of ginkgolides in Ginkgo biloba leaves and phytopharmaceuticals.J Chromatogr,1991,543:375
5　　Pietta P G,et al.Analysis of terpenes from Ginkgo biloba L.extracts by RP-HPLC.Chromatographia,1990,29:251
6　　虞杏英等.高效液相色谱分析银杏叶中的银杏内酯B.药物分析杂志,1993,13(2):85

(本文于1998年2月10日修改回)

Determination of Three Ginkgolides in Ginkgo biloba Leaves by HPLC

Chi Jingduan,Liu Airu and Xu Lixin

(Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing,100050)

　　Abstract:Three kinds of ginkgolides(ginkgolide A,ginkgolide B and ginkgolide C)were determined by RP-HPLC using external standard method.The column was packed with Zorbax ODS(150 mm×4 mm,5 μm).The mobile phase consisted of methanol-tetrahydrofuran-water(1∶1∶8),the flow rate was 1 mL/min and detection was affected at 220 nm.This method is accurate and reproducible.
　　Key words:Ginkgo biloba L.,ginkgolides,RP-HPLC