HPLC测定决明子中决明子苷A，B含量

　　摘要　

目的：建立决明子中降血脂有效成分决明子苷A，B(以下简称苷A，B)的HPLC定量测定方法。

方法：决明子药材经氯仿脱脂后再由甲醇提取，甲醇提取液经释释后直接进样分析；在μ-Bondapak C₁₈柱上，以乙腈--水-四氢呋喃-冰醋酸(20∶76.5∶3.0∶0.5)为流动相，流速为1ml^.min^-1，检测波长为278nm，测定了样品中苷A、B含量，并采用光谱法和色谱法对A、B峰的色谱纯度进行了鉴定。

结果：苷A、B的保留时间分别为12.13min和13.27min，经鉴定苷A、B峰均为单一物质色谱峰：苷A、B的标准曲线分别在0.25～1.25μg(r=0.9999)和0.125μg～0.625μg(r=0.9999)之间有较好线性关系，苷A、B的加样回收率分别为(96.83±3.53)%和(97.78±2.16)%。

结论：本法专属性强，可用于决明子中决明子苷A、B的含量测定。

Analysis of cassiaside A and B in the seeds of Cassia obtusifolia by HPLC

Liu Songqing (Liu SQ),Gao Zhentong (Gao ZT),Yang Dajian (Yang DJ),et al (Department of Pharmacy,Southwest Hospital,The Third Military Medical University,Chongqing400038 )

　　ABSTRACT　OBJECTIVE:To establish a HPLC assay for determining cassiaside A and B in the seeds of Cassia obtusifolia L.METHODS:The dried powder of the seeds of the plant was defatted with CHCl₃ in a Sothles apparatus followed by extraction with MeOH.The MeOH extra was injected for analysis.A μ-Bondapak C₁₈ column (3.9nm×300mm,10μm) was used with a mobile phase of acetonitrile-water-THF-acetic acid (20∶76.5∶3.0∶0.5).The flow rate was 1.0ml^.min^-1.A UV detector at 278nm was used.The peaks of cassiaside A and B were identified by co-chromatography and spectrophoto metry with their standards.RESULTS:The peas of cassiaside A and B in the chromatogram from seeds C. obtusifolia are pure.The retention time of A and B were 12.13 min and 13.27 min,respectively.The standard curves of A and B were linear in the range from 0.25 to 1.25 μg (r=0.9999) and 0.125 to 0.625 μg (r=0.9999),respectively.The average recoveries were (96.83±3.53)% for A and (97.78±2.16)% for B.CONCLUSION:The method is sensitive and specific.It is suitable for analysis of cassiaside A and B in the medicinal materials.

　　KEY　WORDS　cassiaside A and B,Cassia obtusifolia L,HPLC

　　决明子为豆科植物决明(Cassia obtusifolia L.)的干燥成熟种子^［1］。有祛风散热，清肝明目，润肠通便之功效。决明子中含有多种蒽醌类成分和萘并吡喃酮类成分^［2～3］。据报道^［3～4］决明子中某些蒽醌苷和萘并吡喃酮苷具有对抗四氯化碳和半乳糖胺对原代培养小鼠肝细胞毒害的作用。现代药理学研究表明，决明子有明显降低血脂的作用，通过对决明子醇浸膏的药理实验，确证决明子醇浸膏对高血脂模型小鼠和大鼠TC和TG均有明显降低作用，并筛选到其降血脂的有效成分。从中分离得到了新的萘并吡喃酮糖苷类化合物A和B(以下简称苷A，B)。为分析决明子中降血脂有效成分的含量，本实验采用HPLC，以苷A，B为对照品，测定了不同产地决明子粗粉甲醇提取物中萘并吡喃酮糖苷A，B的含量，为评价决明子药材品质提供了科学的依据。

1　仪器和药品

　　Waters 810液相色谱仪，包括510泵，484可变波长紫外检测器，U6K进样器，Baseline 810计算机控制及处理系统。Beckman Du-70型紫外分光光度计(带100μl微池)。Mili-Q Plus超纯水器(Millipore)。H66025超声波清洗机(无锡市超声电子设备厂)。决明子，分别产于贵州、四川、广州、安徽、杭州。经鉴定均为决明(Cassia Obtusifolia L.)成熟种子。苷A，B对照品(四川中药研究所)，经HPLC分析，其含量分别为99.5%和98.5%。甲醇和乙腈为色谱纯，水为去离子水，其它试剂均为分析纯。

2　方法和结果

2.1　供试品溶液的制备
分别取不同产地的决明子生品和炒制品(安徽)过5号筛粗粉2g，装入滤纸袋，在索氏提取器中先以氯仿回流提纯至无色，药粉中氯仿挥干后用甲醇提取至无色，将甲醇提取液浓缩至20ml后于50ml量瓶中，用甲醇-水(1∶1)稀释至刻度。精密量取2ml稀释液于10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，备用。

2.2　色谱条件及色谱图
μ-Bondapak C₁₈柱(3.9mm×300mm，10μm)；流动相：乙腈-水-四氢呋喃-冰醋酸(20∶76.5∶3.0∶0.5)(经超声脱气后使用)；流速1ml^.min^-1；柱温(30±1)℃；检测波长：278nm；灵敏度：0.05AUFS；进样量：10μl。
在此色谱条件下，苷A，B混合对照品及样品色谱图见图1，2。从图1中可见苷A，B之间分离良好，在决明子粗粉提取物色谱图中，苷A，B与其它峰之间亦分离良好。

图1　决明子苷A，B对照品色谱图

图2　决明子样品色谱图

2.3　苷A、B的鉴定
2.3.1　光谱鉴定　取苷A、B对照品适量，用流动相配成适当浓度，同时分别收集决明子样品中苷A、B相应保留时间的流出物，在紫外分光光度计下测定其紫外吸收光谱，其结果见图3，4。图中可见对照品及样品相应色谱流出物紫外光谱一致。

图3　苷A紫外光谱图
1-对照品；2-色谱流出物

图4　苷B紫外光谱图
1-对照品；2-色谱流出物

2.3.2　色谱鉴定　取苷A，B对照品适量分别加入决明子粗粉提取液中，在上述条件下分别进样，所得色谱图与原样品色谱图比较，当加入苷A时，保留时间为12.13min的峰面积明显增加；当加入苷B时，保留时间为13.27min的峰面积明显增加。
取决明子粗粉提取液进样20μl，分别收集苷A，苷B相应保留时间的流出物，于50℃条件下，以氮气流吹干，备用。改变流动相为甲醇-水(1∶1)，将色谱流出物用流动相0.1ml溶解，进样50μl，所得色谱图苷A、B流出物均为单一峰，其保留时间分别为9.01min和9.12min。
经光谱、色谱鉴定，可以确定保留时间为12.13min的峰为苷A，保留时间为13.27min的峰为苷B，且其纯度基本达到单一物质水平。

2.4　标准曲线制备
准确称取苷A，B对照品各2mg，用甲醇分别定容至10ml。然后取A液，B液适量于10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，配制成含苷A 0.05μg^.μl^-1、苷B 0.025μg^.μl^-1的对照品液。用微量进样器吸取对照品溶液5，10，15，20，25μl注入色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，用对照品进样量(c，μg)对峰面积(R)进行线性回归，得苷A回归方程为：c=-2.834×10^-3+3.131×10^-7R，r=0.9999，苷B回归方程为：C=2.502×10^-3+1.841×10^-7R，r=0.9999。

2.5　回收率试验
取3份已知浓度的同一样品液1ml(相当于对照品苷A 0.1817mg^.ml^-1，对照品苷B 0.1226mg^.ml^-1)，依次加入苷A对照品溶液(0.2mg^.ml^-1) 1，1.5，2ml；苷B对照品溶液(0.2mg^.ml^-1)1，1.5，2ml，分别定容至10ml，依法进行测定，计算回收率。结果见表1。

表1　回收率测定结果.n=3

表2　对照品溶液日内、日间稳定性试验结果.n=3

3　讨　论

3.1　在确定色谱条件时，我们试用了几个流动相系统，发现乙腈-水系统较其它系统有较满意结果，在乙腈-水系统中加入四氢呋喃后，峰形大为改观，分离效果最好。

表3　样品含量测定结果.±s

3.3　文献报道^［2］小决明子炮制后保肝类成分含量下降，本实验对安徽生品采用《中国药典》(1995年版一部)规定方法炮制后，作生品和炒品含量对照，在炒品中A物质和B物质的含量均比生品低，证实了决明子炮制后其萘并吡喃酮糖苷含量有所下降。

3.4　通过对不同产地5个品种决明子中苷A、B含量进行研究。发现其含量有所不同，广州产品中苷A含量最高，其次为安徽，杭州。而苷B含量最高的为四川产品，贵州产品苷A、B含量均较低。该结果提示；在制备决明子醇浸膏制剂时，因其中成分含量差异较大，要确保其制剂质量，选择合适产地的药材是必要的。

作者单位：刘松青　高振同　代青　孔令冰（重庆400038第三军医大学西南医院药剂科）
杨大坚（重庆400065四川省中药研究所）

参考文献
[1]　中国药典1995年版一部.1995：121.
[2]　张启伟，阴健，张俊.生、炒决明子及其煎剂中部分活性成分的比较.中草药，1996，27(2)：79.
[3]　Wong SM,Wong M,SeligmannO,et al.New antihepa-totoxic Naphthopyrone Glycosides from the seeds of Cassia tora.Planta Med.1989,55(3):276.
[4]　Wong SM,Wong M SeligmannO,et al.Anthraqulnong Glycosides from the seeds of Cassia tora.Phytochemistry.1989,28(1):211.

(收稿：1997-12-09)