HPLC法测定黄芪中的黄芪甲苷含量

摘　要：用HPLC法测定了黄芪甲苷含量.样品从东北黄芪中提取，用色谱纯甲醇溶解并稀释，采用YWG-C₁₈柱，流动相为甲醇，在205 nm下检测，灵敏度为0.1 AUFS,测定了黄芪甲苷的含量.平均回收率为96.1%，RSD为2.15%，结果表明，样品浓度在0.01～0.2 mg/mL之间与峰面积成良好的线性关系.

High-performance Liquid Chromatographic Determination of
Astragaloside in Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge.

Tian Feng，Deng Yingjie
（Department of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015）

Abstract：A sensitive method was developed to determine astragaloside by high-performance liquid chromatography with the C₁₈ column.The mobile phase was methanol and the UV absorbency was monitored at 205 nm.This assay demonstrated that astragaloside had adequate sensitivity and selectivity to measure the concentrations of astragaloside in Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge.
Key words：high performance liquid chromatography；astragaloside;Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge.▲

　　黄芪为常用中药，素有“补药之长”之称，具有益气固表，利尿托毒等功效.黄芪药用价值很高，临床上常用来治疗非特异性免疫功能低下、乙肝和心血管系统疾病.黄芪甲苷作为黄芪成分之一，其化学结构如图1所示，它具有降压、抗炎、稳定红细胞膜、提高血浆cAMP含量，促进小鼠再生肝DNA合成和增强免疫功能等多种作用^〔1〕.因此在研究黄芪过程中，我们对其成分黄芪甲苷进行了含量测定方法研究.已有的测定方法多为薄层扫描法^〔2〕和香草醛-硫酸比色法^〔3〕，前者操作繁琐，背景干扰多，误差较大；后者空白吸收值高，受时间因素干扰大，均难以准确测定.本文试用HPLC法测定黄芪甲苷的含量.其样品浓度的范围在0.01～0.2 mg^.mL之间与峰面积呈线性，该法灵敏度高，重现性好，可准确地测定东北黄芪甲苷的含量.

Fig.1　The formulation of astragaloside

1　仪器与方法

　　仪器：Waters高效液相色谱仪，510型泵，490E紫外检测仪.
对照品　黄芪甲苷购自中国药品生物制品检定所.
样品　黄芪饮片(生品)，购自沈阳京盛药店，本校许春泉教授鉴定为东北黄芪.
试剂　乙腈(色谱纯，天津四友生物医学公司)、甲醇(色谱纯，天津四友)、正丁醇(分析纯)、乙醚(分析纯)、水、重蒸馏水、去离子水、中性氧化铝(层析用)、轻质氧化镁(AR).

2　方法与结果

2.1　色谱条件
色谱柱：YWG₁₈柱250 4.6 mm 10μL，大连依利特科学仪器有限公司；流动相：甲醇(色谱纯)；流速：0.8 ml/min；检测波长：205 nm；灵敏度：0.1AUFS.
2.2　标准曲线的绘制
精密称取10.03 mg黄芪甲苷标准品，置于50 mL容量瓶中，加入色谱纯甲醇溶解并定容，分别精密吸取0.5、1.5、2.5、5、10 mL用甲醇稀释并定容于10 mL容量瓶中，用0.45 μ微孔滤膜过滤，进样20 μL，按上述色谱条件测定.在t_R=3.375左右有唯一吸收峰，以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，得一工作曲线.回归方程为A=0.171 7C+0.465 7，r=0.999 6，线性范围0.01～0.2 mg/mL^-1，如表1所示.

Tab.1　The concentration and peak area of the standard sample

C／(mg^.mL^-1)×10^-1

Peak area/×10⁶

0.1

0.483 0

0.3

0.507 8

0.5

0.552 1

1.0

0.633 0

2.0

0.820 0

2.3　精密度实验
精密称取黄芪甲苷对照品4.50 mg，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，精密吸取20 μL进样，连续5次，测定峰面积，其RSD为2.14%.
2.4　回收率试验
取5 g已测定黄芪甲苷含量的生药提取水煎液平均分成10份，取5份，再分别准确加入1.447 mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液0.5 mL，按“样品测定”项下方法操作，结果见表2.

Tab.2　The results of recovery

The content of astragaloside
in sample/mg

The adding weight
of astragaloside/mg

Measuremental
weight/mg

Recovery/%

0.675

0.723 5

1.359

94.6

0.675

0.723 5

1.369

93.5

0.675

0.723 5

1.365

96.5

0.675

0.723 5

1.376

97.2

0.675

0.723 5

1.392

98.7

　　x=96.1%，RSD=2.15%

2.5　稳定性实验
样品溶液在室温下放置，每隔3h测定1次，12h内共测5次，含量分别是1.350、1.347、1.352、1.349 mg/g，RSD为2.45%，证明黄芪甲苷含量至少12h内稳定.
2.6　样品测定
将黄芪水提取液50mL(相当于含生药50g)加热浓缩至30mL，加大量甲醇至上清液再加甲醇无浑浊，醇沉多糖，抽滤，滤液用真空旋转薄膜蒸发器回收甲醇至干，残渣加少量H₂O制成水溶液，用100mL乙醚振摇萃取脱脂3次，取水层加水饱和正丁醇的上层液萃取数次，合并正丁醇液，减压旋转蒸发正丁醇至干，残渣加少量95%乙醇溶解，然后均匀滩洒在装有干燥Al₂O₃∶MgO(36 g∶9g)混合物的G₃漏斗中，并用75%洗脱3h，洗脱液回收乙醇后得残渣用95%乙醇溶解，得乙醇液加大量乙醚，抽滤，弃去滤液，滤渣附于滤纸上使其自然挥干乙醚，将滤纸浸于甲醇中使滤渣充分溶解，弃去滤纸，定容至50mL，备用，精密吸取1mL置50mL容量瓶中，用色谱纯甲醇定容至刻度，振摇，过微孔滤膜，进样20μL，按上述色谱条件测定，并由回收方程计算含量，得图谱(图2、3)，结果如表3.

Fig.2　The chromatogram of the sample

Fig.3　The chromatogram of control

Tab.3　The measuremental results of the sample content

n

1

2

3

4

5

Mean

A(×10⁶)

0.514 579

0.508 208

0.501 172

0.517 491

0.516 960

0.511 682

　　n=5，RSD=0.694%，Ai=0.511 682×10⁶，Ci=0.027 mg^.mL^-1

　　则50 g药中黄芪甲苷为67.5 mg,相当于每克生药中含黄芪甲苷1.35 mg.

3　讨论

　　a.本实验考察了黄芪水提取液醇沉除多糖和蛋白质，乙醚除脂类物质，过Al₂O₃∶MgO滤层除黄酮，最后制得甲醇浸液的工艺，结果表明，此方法提取完全，损失少，分离度良好.
b.日本的原田正敏^〔4〕报道了用乙腈-水(1∶2)作为流动相测定黄芪皂苷(即黄芪甲苷^〔1〕),我们经实验发现在此流动相下出现倒峰，峰形不好，且受流动相影响大，不易把握保留时间，我们也考察了(甲醇：水)不同比例作为流动相的实验结果，最终选择甲醇为流动相能得到最佳效果.
c.鉴于黄芪皂苷种类较多，结构相近，紫外扫描只在200 nm有末端吸收^〔1〕，原田正敏因此定在200 nm处检测^〔4〕.我们实验表明，波长越长，噪音越小，但灵敏度越低；越靠近200 nm，灵敏度越高，但噪音越大.综合考察这两个因素，本实验选择205 nm为测定波长.
d.黄芪中甲苷的含量很低，而且受产地、生长时间、采收季节等因素影响，具体差异有待于进一步研究.■

作者单位：田丰（沈阳药科大学药学系，沈阳　110015）
　　　　　邓英杰（沈阳药科大学药学系，沈阳　110015）

参考文献：

［1］余灏，杨胜华.黄芪皂苷分析方法研究近况.华西药学杂志，1993，8(3)：163～166
［2］鲁静，王宝琴.黄芪甲苷的薄层扫描法测定.中成药，1992，14(6)：34～35
［3］俞家华,曹正中，张勤.膜荚黄芪中黄芪甲苷的含量测定.中药通报，1986，11(9)：38～39
［4］原田正敏.日本常用生药的定量方法.国外医药.植物药分册，1990，5(5)：201～202

收稿日期：1999-01-16