柱前手性衍生化反相高效液相色谱分离酮洛芬对映体

摘　要：

目的：建立柱前手性衍生化反相高效液相色谱法分离酮洛芬对映体的方法。方法：分别以二氯亚砜和1，1′-羰基二咪唑为酰化剂，R-(+)-α-甲基苄胺作为柱前手性衍生化试剂，甲醇-0.025 mol^．L^-1磷酸二氢钾溶液(70∶30)作流动相，在Shim-Pack CLC-ODS柱上反相色谱分离酮洛芬对映体衍生物，柱温，室温。

结果：在选定的条件下，酮洛芬的对映体衍生物得到分离，并确认了R-(-)-和S-(+)-两个衍生物的色谱峰。

结论：通过酰化，再以R-(+)-α-甲基苄胺为柱前手性衍生化试剂，用反相色谱法，实现了对酮洛芬对映体的分离。

Separation of enantiomeric ketoprofen by pre-column chiral derivatization reversed-phase HPLC

Zhao Hua (Zhao H)　Mu Zhaode (Mu ZD)　Li Huizhi (Li HZ)
(Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400016)

ABSTRACT：OBJECTIVE：To establish a pre-column chiral derivatization reversed-phase high performance liquid chromatographic method for the separation of ketoprofen enantiomers.METHODS：Thionyl chloride and 1,1′-carbonyldiimidazole were chosen as the reagents for acylation,respectively.R-(+)-α-methylbenzylamine as the reagent for pre-column chiral derivation to give two diastereomeric acylamide derivatives.These derivatives were separated on a Shim-Pack CLC-ODS column using MeOH-0.025 mol^．L^-1KH₂PO₄(70∶30) as the mobile phase and detected by UV detector at a wavelength of 254 nm.RESULTS：Two diastereomeric acylamide derivatives were effectively separated under the chosen conditions,and two peaks were determined.CONCLUSION：A simple highly sensitive method for the separation of ketoprofen was established.It may be a suitable analysis method for ketoprofen enantiomers pharmacology studies.It may also be a purity detective method for ketoprofen eanantiomers.
KEY　WORDS：RP-HPLC,ketoprofen,enantiomer,R-(+)-α-Methylbenzylamine▲

　　酮洛芬(ketoprofen)为2-(3-苯氧苯基)丙酸［(±)-2-(3-benzoylphenyl)-propionic acid］,是一种α-芳基丙酸非甾体类抗炎药物，临床使用均以外消旋体形式。Mauleon等^［1］对酮洛芬的(S)-(+)对映体的临床前药理和临床药理作了大量研究，发现其作用几乎为同剂量消旋异构体的两倍，其高镇痛强度为布洛芬的20～40倍，几乎与度冷丁相当，对中等及剧烈疼痛均有效，且镇痛作用起效迅速，无成瘾性，不良反应少，患者耐受性好。手性药物的分离分析可采用手性固定相高效液相色谱法直接分离，但每类手性柱能分离的样品有限，且价格昂贵。对酮洛芬异构体的分离，国外有用手性柱高效液相色谱法直接分离的报道^［2］，也有柱前衍生化高效液相色谱法间接分离α-芳基丙酸类药物的报道^［3～4］，均采用正相高效液相色谱法。作者尚未见国内分离酮洛芬异构体的文献报道。本实验分别以二氯亚砜和1，1′-羰基二咪唑为酰化剂，R-(+)-α-甲基苄胺为手性衍生化试剂用反相高效液相色谱法分离酮洛芬对映体，获得了满意的结果，为酮洛芬各异构体的药理学研究提供了有效的分析方法，同时也为发展单一异构体药物提供了必须的纯度检测手段。

1　仪器和试剂

1.1　仪器
　　岛津LC-6A液相色谱仪，配用SPD-6A UV-VIS检测器和C-R3A数据处理系统，色谱柱为岛津Shim-Pack CLC-ODS柱(150 mm×6.0 mm，10 μm);Elgastat UHO超纯水器(英国Elga公司)；Model SA720 pH计(美国Orion公司)；SHZ-88台式水浴恒温振荡器(江苏太仓实验设备厂)。
1.2　试剂及药品
R-(+)-α-甲基苄胺和1，1′-羰基二咪唑(CDI，Sigma公司)；(±)-酮洛芬和S-(+)-酮洛芬(西南合成制药厂提供)；氯化亚砜(SOCl₂)、甲醇、三氯甲烷(CHCl₃)、冰醋酸、正己烷、硫酸、盐酸和氨水均为国产分析纯试剂：水为超纯水；
(±)-酮洛芬配制成0.1 mg^.ml^-1的甲醇溶液和三氯甲烷溶液备用，S-(+)-酮洛芬配制成0.1 mg^.ml^-1的甲醇溶液备用。

2　方法和结果

2.1　实验方法
2.1.1　衍生化　酮洛芬是一种α-芳基丙酸，为加快其与胺反应生成酰胺的反应速度，同时使反应更加完全，一般先用酰化剂将它的羧基转化成酰基，再与胺反应。本实验分别以1，1′-羰基二咪唑和二氯亚砜为酰化剂，将酮洛芬的羧基转化成酰基后再与R-(+)-α-甲基苄胺反应。
方法一：以1，1′-羰基二咪唑为酰化剂。取0.1 mg^.ml^-1酮洛芬的CHCl₃溶液0.1 ml，加入1，1′-羰基二咪唑(65 mg^.ml^-1CHCl₃溶液)(新鲜配制)0.5 ml，旋转混匀10 min。然后加入冰醋酸10 μl，继续旋转混匀10 min。加入R-(+)-α-甲基苄胺25 μl，旋转混匀25 min，再继续反应30 min后，向反应液中加入0.2 ml^.L^-1NH₃ 1.0 ml，正己烷2 ml提取15 min，离心10 min(1500 r^.min^-1)。取有机层加0.2 mol^.L^-1HCl 1 ml，混匀，离心，有机层用N₂吹干.残留物用甲醇0.2 ml溶解，取10 μl进样。
方法二：以二氯亚砜为酰化剂。取酮洛芬的甲醇溶液0.1 ml于带聚四氟乙烯塞子的试管中，N₂气吹干甲醇后，加入1.2%氯化亚砜正己烷溶液(新鲜配制)0.1 ml，混匀，塞紧试管塞，于75℃水浴中反应1 h。反应液冷至室温后加2% R-(+)-α-甲基苄胺的二氯甲烷溶液(新鲜配制)0.5 ml，75℃下继续反应15 min。反应液冷至室温，加入2 mol^.L^-1硫酸0.2 ml，正己烷2 ml，混匀，提取15 min，离心10 min (1500r^.min^-1)。取有机相用N₂吹干。残留物用甲醇0.2 ml溶解，取10 μl进样。
2.1.2　色谱分离条件　流动相为甲醇-0.025 mol^.L^-1磷酸二氢钾溶液(pH=4.45)(70∶30)，流速1 ml^.min^-1，纸速1 cm^.min^-1，柱温：室温，检测波长：254 nm。
2.2　结果
通过方法一、方法二，酮洛芬的对映体转变为2个非对映异构体衍生物，此衍生物可在反相色谱条件下分离，其色谱条件：甲醇-0.025 mol^.L^-1磷酸二氢钾溶液(pH=4.45)(70∶30)，柱温：室温，流速1 ml*min^-1。分离的色谱图如图1。

图1　(±)酮洛芬与R-(+)-α-甲基苄胺衍生物的色谱图
A-方法一；B，C-方法二；1-R-(+)-酮洛芬(t_R12.66 min);2-S-(+)-酮洛芬(t_R 13.33 min);3-R-(+)-酮洛芬(t_R 12.71 min);4-S-(+)-酮洛芬(t_R＝13.50 min)；5-S-(+)-酮洛芬(t_R 13.51 min)

3　讨　论

　　方法一中酮洛芬与1，1′-羰基二咪唑的反应很迅速，而后一步反应则较慢，反应时间较长，一般不少于30 min^［5］。尽管方法一反应步骤稍长，且1，1′-羰基二咪唑的贮存条件苛刻，但实验操作简单，衍生效率高，重现性好，缺点是1，1-羟基二咪唑不易获得和贮存。
方法二中，由于二氯亚砜是易挥发和易分解的物质，因此二氯亚砜溶液必须新鲜配制，且操作必须严格，否则二氯亚砜的用量难以控制。同时，本方法的衍生化效率也不如方法一理想(相同量的酮洛芬用不同方法衍生，方法一衍生物的峰面积大于方法二衍生物的峰面积)。这可能是由于酰氯与R-(+)-α-甲基苄胺反应时的产物中有HCl产生，它一方面消耗碱性的R-(+)-α-甲基苄胺，另一方面HCl与R-(+)α-甲基苄胺生成的胺盐抑制酰氯与R-(+)α-甲基苄胺的反应。方法二的优点是反应时间较短，且氯化亚砜易于获得。
为使衍生化反应完全，酰化剂和苄胺必须过量，过量的酰化剂和苄胺与衍生物能很好的分离，不影响酮洛芬异构体的分析。
我们曾使用了pH3.08，pH5.54和pH6.47磷酸缓冲溶液配合甲醇作流动相，流动相组成均为甲醇-0.025 mol^.L^-1磷酸缓冲液(70∶30)。实验发现在本文选定的分离系统下，上述流动相pH值的改变对各成分分离度影响不大。这可能是由于生成的酰胺碱性太弱，pH值的改变几乎不改变其存在状态所致。故本实验直接选用0.025 mol^.L^-1的磷酸二氢钾溶液配合甲醇作流动相，同样可以获得满意的分离效果。■

作者单位：赵华(重庆医科大学药物化学与生物材料研究室，重庆，400016)
母昭德(重庆医科大学药物化学与生物材料研究室，重庆，400016)
李惠芝(重庆医科大学药物化学与生物材料研究室，重庆，400016)
邱宗荫(重庆医科大学药物化学与生物材料研究室，重庆，400016)

参考文献：

［1］Mauleon D.Preclinical and clinical development of dexketoprofen.Drugs,1996，52(Suppl 5):24.
［2］Castellani L,Flieger M,Sinibaldi M.Enantiomer separation of 2-arylpropionic acid on an ergot alkaloid-based stationary phase mircobore column application.J Liq Chromatogr,1994,17(17):3695.
［3］Maitre JM,Boss G,Testa B.HPLC separation of enantiomers of anti-inflammatory α-arylpropionates:suitablity of the method for iv vitro metabolic studies.J Chro matogr,1984,299:397.
［4］Hayball PJ,Nation RL,Bochner F.Enantiospecific analysis of Ketoprofen in plasma by HPLC.J Chromatogr,1991,570:446.
［5］VanGiessen GJ,Kaiser DG.GLC determination of Ibuprofen［dl-2-(p-Isobatylphenyl) propionic acid］.J Pharm Sci,1975,64:798.

收稿日期：1999-12-11