用HPLC法同时测定丹参中的迷迭香酸、紫草酸B和相关的酚酸

用HPLC法同时测定丹参中的迷迭香酸、紫草酸B和相关的酚酸

郭丽冰（华东理工大学应用化学系97级 上海 200237）,
施超欧(华东理工大学分析测试中心 上海 200237)翻译
原文：J.Agric.Food Chem., 1998,46,2651-2654

摘要：为了同时分离和测定迷迭香酸、紫草酸B、咖啡酸和其他酚酸化合物开发了一种梯度洗脱的反相HPLC法。这个方法表现出令人满意的结果。这些酚酸化合物的检测限为≤0.05mg/L。这个刚开发的方法应用于测定丹参干燥根（丹参）和丹参的突变细胞中的酚酸化合物。在突变细胞中，迷迭香酸是主要的酚酸化合物。同时检测出少量的紫草酸B和咖啡酸。与之相反，在干燥根中，紫草酸B是主要的酚酸化合物并且只发现了少量的迷迭香酸。除此以外，在干燥根中还检测出丹参素和一些未确定的酚酸化合物。

关键词：酚酸，迷迭香酸，紫草酸B，咖啡酸，丹参，HPLC 

简介
    丹参在传统中药中被广泛应用于治疗各种疾病（Liu et al.,1992），因为它能积累大量的活性化合物，所以它受到了广泛的关注，这些化合物是丹参酮(Chen et al.,1997)和酚酸化合物(Tanaka et al.,1989;Kamata et al.,1993,1994;Morimoto et al.,1994;Hase et al.,1997)。这类植物酚酸的抗氧化活性对人类的健康可能有潜在的益处(Pearson et al.,1997)。酚酸的抗氧化活性通常认为是归因于他们的羟基基团(Chen and Ho,1997)。在丹参的水相萃取液中分离出的七种酚酸化合物显示出强烈的保护作用，此作用是反抗过氧化作用对生物的线粒体、肝细胞和红细胞的危害(Liu et al.,1992)。紫草酸B具有增加冠状动脉流量的作用(Kamata et al.,1993)，并且在治疗高血压症时或许非常有用(Kamata et al.,1994)。无论体外还是体内试验均表明紫草酸B盐可提高肝细胞的活性(Hase et al., 1994)，同时它对治疗尿毒症有一定的作用(Tanaka et al.,1989)。除此以外，迷迭香酸(Mazumder et al.,1997;Arda et al.,1997)、紫草酸盐和迷迭香酸盐(Lim et al.,1997)可能是用于治疗人类的免疫缺陷滤过性病原体Ⅰ型病毒（HIV-1）的强活性物质。

    在药物化学和生物化学中，快速的定性和定量分析这些酚酸化合物已经成为一个中心问题。目前为止已经开发了一些反相HPLC和TLC方法来检测这些化合物中的一部分。可以用等梯度反相HPLC法来检测丹参(Morimoto et al.1994)的愈合组织、再生幼苗和培养植物的干燥组织中的紫草酸B和迷迭香酸。梯度洗脱反相HPLC法也可以用于分析Cordia spinescens (Lim et al.,1997)的水相萃取物中的紫草酸盐和迷迭香酸盐，也可以分析Ocimun Basiliam (Tada et al.,1996)的毛状培养基中的迷迭香酸、紫草酸和紫草酸B。曾有报道用TLC-光密度法来平行检测5种琴柱草类植物中的迷迭香酸和咖啡酸(Janicsak 和Mathe,1997)。除此以外，已经开发了一种组合分析法，这个方法是通过将TLC和FAB-MS技术(Kamata et al.,1993)联合来测定丹参的水相萃取液中的紫草酸B，通过与标准样品比较光谱数据和TLC谱图来测定Sanicula europea中的迷迭香酸和咖啡酸(Arda et al.,1997)。
    然而，没有关于同时测定迷迭香酸、紫草酸B、咖啡酸和其它一些酚酸化合物的研究报道。这些酚酸化合物的复杂性使通过简单的色谱操作将它们分离变得非常困难。目前研究的主要目的是开发一种梯度洗脱的反相HPLC法来同时分离的测定丹参干燥根和丹参突变细胞中的这些酚酸化合物。

实验过程
    丹参的突变细胞和干燥根 将未结果的丹参植物用土壤杆菌tumefaciens扭曲C58感染后获得一个丹参的突变细胞培养基，并将它培养在250ml 的震动锥形瓶中，瓶内装有100ml荷尔蒙自由液，加入7-20g/L的蔗糖溶液作为介质。介质的H值调节到5.7，然后在121℃下恒温15min。在旋转型震荡器内避光培养，震荡器的转速为160rpm，温度为25℃。丹参（丹参的干燥根）是在自由市场购买的。

图1.酚酸化合物标准品的HPLC色谱图。各峰分别为：2，原儿茶酸；3，原儿茶醛；4，咖啡酸；5，酚酸化合物A；7，迷迭香酸；8，紫草酸B（略）。

    萃取 收集细胞是将细胞群与介质分离，分离是在真空条件下用Whatman 1号滤纸实现的。然后用蒸馏水洗涤细胞群三次。最后用Heto FD3冷干器将这些细胞冷干。这些干燥的粉末状细胞（30mg）和丹参干燥根（15mg）分别用5ml甲醇萃取。在10000g离心5min后收集浮在表面的物质，则混合物就得到分离。这个萃取过程至少重复三次。所有萃取物都用0.45um的滤纸过滤，然后直接注射入HPLC仪，这样就可以测定酚酸化合物。

药物和试剂 来自BDH化学品供应商的甲酸和HPLC级甲醇，从Sigma购买的咖啡酸、原儿茶醛和原儿茶酸。从ICN购买的迷迭香酸。K.Kamata和Y.M.Xu分别赠送的紫草酸B。丹参素是上海医科大学提供的。
    HPLC方法HPLC是Waters液相色谱仪，配备有2个510泵和1个996光电二极管检测器。萃取液用250×4.6mm的Beckman Ultrasphere C18（5um）色谱柱在30℃下分离和分析（每次进样20ul）。流动相由溶剂A（甲醇/水/甲酸，14.0：85.2：0.8，V/V）和溶剂B（甲醇/水，65：35，V/V）组成。为了同时测定迷迭香酸、紫草酸B、咖啡酸及其它相关的酚酸化合物，使用的梯度洗脱过程为：0%的B溶液2min，B溶液从30%到45%的线性梯度时间为8min，流速为1.0ml/min，记录从200到500nm波长范围内的三维谱图。检测波长为280nm，这个波长下可检测迷迭香酸和相关的酚酸化合物。通过与已知标准品比较保留时间和光谱来确定色谱峰。

结果
    已经开发并应用了梯度洗脱过程来分离迷迭香酸、紫草酸B、咖啡酸和相关的酚酸化合物。图1所表示的是标准品混合物和待测样品的色谱图，表1所列的是它们的色谱数据。正如图1所示，原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸和紫草酸B都得到了很好的分离。
峰面积（A）对比浓度（C）的校准曲线有一个较宽的线性范围，此范围覆盖的物质有迷迭香酸（A=45043C-14816，r=0.9991）、紫草酸B （A=20922C+5135.3，r=0.9992）、咖啡酸（A=69276C+27549，r=0.9984）、原儿茶酸（A=25686C+22913，r=0.9995）。这些化合物重复注射（n=5）的相对标准偏差分别为迷迭香酸2.27%、紫草酸B2.67%、咖啡酸3.95%、原儿茶醛5.06%、原儿茶酸2.86%。为了证明分析的准确性，回收率是用标准品添加法确定的。将一定量的标准品添加到样品中。在两个水平，即加入两个不同浓度的标准样品，测定三次。样品中的5种酚酸化合物的含量和回收率列于表2。
    作为一个应用方法，丹参的干燥根和突变细胞中的酚酸化合物被分离和测定。图3所表示的是丹参的干燥根和突变细胞的萃取物的典型色谱图。通过与已知标准品比较保留时间和光谱图来确定这些酚酸化合物。通过与迷迭香酸比较峰面积来测定5种未确定化合物（化合物A-E）的含量。检测结果列于表3。

讨论
    在目前的研究中，我们使用甲醇、甲酸和水的混合溶剂作为流动相，从丹参萃取物中分离出迷迭香酸和相关的酚酸化合物。结果表明，甲酸的存在可将峰拖尾减至最少，并提高这些酚酸化合物的分离效果。这些酚酸化合物的保留行为和分离效果显然受到流动相中甲醇的含量的影响，尤其是对紫草酸B和迷迭香酸。甲醇的含量升高则迷迭香酸和紫草酸B的保留时间会减少并且改善它们的峰形，但是继续增加甲醇的含量则迷迭香酸和紫草酸B的分离效果变坏。当进一步增加甲醇的含量时迷迭香酸和紫草酸B的洗脱顺序会颠倒。与迷迭香酸和紫草酸B相比较，原儿茶酸、咖啡酸和原儿茶醛在反相色谱柱中的保留时间很短。这是因为它们的极性差异很大，所以用等梯度洗脱法很难将迷迭香酸、咖啡酸、紫草酸B、原儿茶醛和原儿茶酸同时分离。根据报道HPLC法并不适合用于同时测定迷迭香酸和咖啡酸。因此，在目前的研究中，我们运用梯度洗脱过程来分离迷迭香酸和相关的化合物。

表1. 定丹参的干燥根（丹参）和突变细胞中的酚酸化合物
峰号 保留时间（min） 最大吸收值（nm） 化合物 检测极限（mg/L）
1 6.6 233.5 280.6 丹参素
2 7.2 230.0 258.2 295.8 原儿茶酸 0.01
3 8.3 234.6 281.9 310.2 原儿茶醛 0.005
4 10.4 239.8 324.4 咖啡酸 0.004
5 21.8 230.0 286.8 324.2 酚酸化合物A
6 24.7 228.8 252.3 290.0 309.0 酚酸化合物B
7 26.3 229.9 329.2 迷迭香酸 0.02
8 31.0 230.0 253.5 286.6 310.2 紫草酸B 0.05
9 33.7 233.5 285.3 酚酸化合物C
10 38.3 228.8 251.9 290.1 304.3 酚酸化合物D
11 45.5 228.8 252.3 290.1 309.0 酚酸化合物E

图2. 测定酚酸化合物的校准曲线（略）

    测定结果表明，正如图3和表3所示，在突变细胞中的酚酸化合物组分显然与天然丹参干燥根中的不同。迷迭香酸已经发现具有抗-HIV活性，是丹参突变细胞中的主要酚酸化合物，而检测出紫草酸B和咖啡酸的含量很少。在丹参干燥根中，紫草酸B、丹参素和两种未确定的化合物是主要的酚酸化合物。在干燥根中只发现很少量的迷迭香酸。
    曾经有报道指出已经将7种酚酸化合物从丹参的水溶性提取物中分离出来，这7种酚酸化合物包括迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B（紫草酸B）、咖啡酸、原儿茶醛、原儿茶酸和丹参素。本次实验中，在丹参的突变细胞和干燥根中均未检测出原儿茶酸。对于丹酚酸A，由于没有标准品，所以不能在丹参干燥根的色谱图（图3b）中确认出丹酚酸A。酚酸化合物B和E的吸收光谱几乎相同（见表1），表明酚酸化合物B和E的结构相似。酚酸化合物A（峰5），见图1，是酚酸化合物标准品的杂质，在迷迭香酸的标准品中被检测出来，同时在丹参的突变细胞和干燥根中也被检测出来。

表2. 加到丹参突变细胞中的标准品的回收率
化合物 含量（mg/g） 添加量（mg/g） 检出量（mg/g） 回收率（%）+RSD
迷迭香酸 9.90 6.0   15.63   95.5+1.4  
15.0   24.40   96.7+2.1  
紫草酸B 0.76 8.0   8.31   94.4+1.8  
15.0   15.61   96.0+1.6  
咖啡酸 0.15 8.0   7.85   96.3+1.3  
15.0   14.88   98.2+1.7  
原儿茶醛 0.02 8.0   7.82   95.7+2.3  
15.0   15.22   101.3+2.7  
原儿茶酸 未检出 8.0   7.74   96.8+2.5  
15.0   15.11   100.7+1.9  

图3. 丹参的突变细胞（a）和干燥根（b）的提取物的HPLC色谱图（略）。各峰分别为：1，丹参素；3，原儿茶醛；4，咖啡酸；5，酚酸化合物A；6，酚酸化合物B；7，迷迭香酸；8，紫草酸B；9，酚酸化合物C；10，酚酸化合物D；11，酚酸化合物E。

表3. 丹参的干燥根(丹参)和突变细胞中酚酸化合物的测定结果（mg/g）
 化合物 突变细胞 干燥根（丹参）
含量（mg/g） 百分含量（%） 含量（mg/g） 百分含量（%）
迷迭香酸 9.90+0.21   90.1    1.66+0.04   3.0   
紫草酸B 0.76+0.02   6.9    28.72+0.78   52.7   
咖啡酸 0.15+0.01   1.4    0.27+0.01   0.5   
原儿茶醛 0.02+0.01   0.2    0.03+0.01   0.1   
原儿茶酸
丹参素 8.71+0.31   16.0   
酚酸化合物A 0.16+0.01   1.4    0.20+0.01   0.4   
酚酸化合物B 4.88+0.10   8.9   
酚酸化合物C 1.27+0.03   2.3   
酚酸化合物D 0.96+0.02   1.8   
酚酸化合物E 7.80+0.17   14.3   

    这个为了在一个色谱操作中同时分离和检测这些酚酸化合物而开发的方法非常有效，得到了令人满意的结果。这个方法可应用于同时检测在植物及细胞组织中的迷迭香酸、紫草酸B、咖啡酸和其它酚酸化合物。