摘 要 目的：建立用高效液相色谱法（HPLC）测定石杉科植物中石杉碱甲（huperzine A）含量的方法。方法与结果：按照常规的方法提取出石杉总生物碱，用HPLC对总碱直接进行分析。色谱条件如下：Spherisorb
C18分析柱，检测波长231.3 nm；甲醇∶水（85∶15,体积分数）作为流动相，流速1 ml/min。外标法测定。该方法的线性范围是0.41～6.15
mg/L；平均加样回收率为99.72%～100.09%。相对标准差为0.33%～0.45%。结论：建立了用HPLC测定石杉科植物中石杉碱甲含量的方法，该方法快速、灵敏、准确。
关键词：石杉碱甲；色谱法，高效液相；含量测定
石杉碱甲（huperzine A）是由徐择邻等于1985年从蕨类植物——石杉科(Huperziaceae)马尾杉属(Phlegmariurus)的华南马尾杉［P.fordii(Baker)
Cheing］中首次分离得到［1］。它是一种可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂［2］，对重症肌无力、记忆力减退和老年性痴呆具有较好的效果［3］。石杉碱甲的片剂已通过卫生部审批上市。石杉科植物有5个属26个种，我国除了华南马尾杉外，还有蛇足石杉［Huperzia
serrata（Thunb）］、长柄石杉［H.longipetiontata(Spring)］、中间石杉［H.serrata f.intermedia
(Nakai)］、长白山石杉［H.luciduca var.asiatica Ching］、四川石杉［H.sutchueniana
(Herter)］、湖北石杉［H.hupehensis Ching］、闽浙马尾杉［P.mingcheensis Ching］、广东马尾杉［P.guangdongensis
Ching］、马尾杉［P.phlegmaria (Linn.) Hulod］、狭叶马尾杉［P.mingcheensis var.angustifolius
C.Y.Ma］、龙岩马尾杉［P.longyanensis C.Y.Ma］、矮小马尾杉［P.nanus C.Y.Ma］等13种。从我们的研究结果看，我国的上述植物基本都含有石杉碱甲，它们均是石杉碱甲的药物资源。但以蛇足石杉含量和蕴藏量相对较多。
由于蕨类植物生长缓慢，繁殖困难，造成了石杉碱甲的原料药价格昂贵，因此，建立一个石杉碱甲含量的快速检测方法很有必要。本文研究了用高效液相色谱法（HPLC）测定蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法。我们首先用石杉碱甲标准品建立分析方法；然后按照常规方法从蛇足石杉中提取出总生物碱，并在HPLC中确定石杉碱甲峰，同时分析总生物碱中石杉碱甲的含量，进而确定被测定植物中石杉碱甲的含量。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪：美国 SP-100泵；SP-200紫外检测器；SP-4600积分仪。
1.2 试剂及样品
甲醇为北京化学试剂厂产品，分析纯；标准品石杉碱甲及石杉总生物碱均由本室提供，主要是由蛇足石杉、华南马尾衫和闽浙马尾杉等石杉混合品按照常规方法提取而成。
2 测定条件及方法
2.1 色谱条件
色谱柱：C18，5 μm，4.6 mm×250 mm（Microsorb-MVTM）;流动相：甲醇∶水（85∶15）；流速：1
ml/min 。
2.2 检测波长的确定
石杉碱甲紫外静态扫描有三条谱带（图1），分别是λ1=201.3 nm ,λ2=231.3
nm,λmax=312.7 nm。在此HPLC系统中，用λ1紫外检测基线不稳定；用λmax则有其他杂峰的干扰，我们选定231.3
nm为检测波长。
图1 石杉碱甲标准品紫外扫描图谱
2.3 计算方法
按照下列公式计算：
X=Ai/Ax (Cs．Vi/Wi)．100%
式中：X——石杉碱甲的含量（%）; Ai——被测样品的峰面积;Ax——被测标准品的峰面积;Cs——标准品浓度（mg
/ml）;Vi——被测样品定溶体积（ml）; Wi——被测样品质量（mg ）。
2.4 标准品的配制
精密称取石杉碱甲标准品20.50 mg,溶解于0.02 mol/L的盐酸水溶液中并定容于100 ml（为备用液）。
3 方法学考察
3.1 线性关系的考察
以外标法定量。分别取备用液2.0，4.0，6.0，10.0，15.0，20.0及30.0 ml置于50 ml容量瓶中，并用流动相稀释至刻度。分别进样同体积测定积分面积，记录并储存色谱图。以石杉碱甲的峰面积Y为纵坐标，对进样量X为横坐标进行回归，得到线性回归方程：Y
=920699X+1448，r=0.999 8。其线性范围在0.410～6.150 mg/L之间。数据见表1。
表1 石杉碱甲校正曲线的数据
| 样品量（m/μg） |
峰面积 |
CV（%） |
| 0.410 0 |
381 335 |
4.27 |
| 0.820 0 |
754 032 |
0.92 |
| 2.300 0 |
1 137 853 |
0.95 |
| 2.050 0 |
1 880 634 |
1.81 |
| 3.075 0 |
2 821 824 |
0.27 |
| 4.100 0 |
3 769 948 |
0.31 |
| 6.150 0 |
5 642 586 |
1.30 |
n=3
3.2 精密度实验
按照上述方法、步骤进行操作，测得该方法的日内精密度及日间精密度（表2、3）。
表2 石杉碱甲日内精密度结果
进样浓度
（ρB/mg．ml-1） |
实测浓度
（ρB/mg．ml-1） |
RSD
（%） |
CV
（%） |
| 0.410 0 |
0.415 5 |
1.89 |
4.55 |
| 1.230 0 |
1.217 8 |
1.44 |
1.17 |
| 2.050 0 |
2.041 1 |
4.54 |
2.22 |
| 3.075 0 |
3.074 6 |
2.66 |
0.86 |
| 6.150 0 |
6.119 8 |
0.56 |
0.09 |
n=3
表3 石杉碱甲日间精密度结果
进样浓度
（ρB/mg．ml-1） |
实测量浓度
（ρB/mg．*ml-1） |
RSD
(%) |
CV
（%） |
| 0.615 0 |
0.608 1 |
1.08 |
1.78 |
| 0.820 0 |
0.817 4 |
0.75 |
0.92 |
| 1.025 0 |
1.022 7 |
1.02 |
1.00 |
| 4.100 0 |
4.092 9 |
1.54 |
0.38 |
n=3
3.3 加样回收率实验
结果见表4。
表4 石杉碱甲加样回收率结果
样品浓度
（mg．ml-1） |
标准品浓度
（mg．ml-1） |
测得浓度
（mg．ml-1） |
回收率
(%) |
RSD
(%) |
| 3.386 7 |
2.000 0 |
3.382 0 |
99.88 |
0.33 |
| 5.568 3 |
3.000 0 |
5.563 3 |
100.09 |
0.41 |
| 6.312 4 |
4.000 0 |
6.294 7 |
99.72 |
0.45 |
4 石杉总生物碱样品的测定
4.1 石杉碱甲峰的确定
在石杉总生物碱中，有50多个生物碱成分。确定总碱在此HPLC系统中的石杉碱甲，则是含量测定的基础。我们经过正向柱（SiO2）、反相柱(C18)与不同的检测波长、不同的流动相、石杉碱甲峰的动态和静态扫描比较等，确定了石杉总生物碱中的石杉碱甲峰（图2）。在反相柱条件下，石杉碱甲峰的保留时间是tR=6.95
min ,紫外动态扫描吸收波长λ2=231.3 nm ,与石杉碱甲标准品的静态扫描的紫外吸收波长λ2=231.3
nm 完全一致，从而确定了此系统中的石杉碱甲峰。
图2 石杉总生物碱HPLC图谱
4.2 保留时间
在该HPLC系统中，石杉总生物碱中的石杉碱甲峰的保留时间是tR=（6.96±0.12 ）min，n=20。
4.3 待分析样品的处理
分别取批号9501,9502,9503,9504和9505的石杉总生物碱50 mg，放入60℃烘箱中恒重24 h。然后分别称取石杉总生物碱9501批20.00
mg，9502批12.2 mg，9503批7.50 mg，9504批10.70 mg和9505批17.21 mg，分别置于10 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，备用。
4.4 样品的测定
按照标准曲线的方法进行含量测定。结果见表5。样品放置一周后再次测定含量没有变化，说明石杉碱甲在此体系中较为稳定。
表5 总碱中石杉碱甲的含量
| 批 |
石杉碱甲在总 |
总碱在植物中 |
石杉碱甲在植 |
| 号 |
碱中含量(%) |
的提取率(%) |
物中含量(%) |
| 9501 |
14.67 |
0.11 |
0.016 |
| 9502 |
3.38 |
0.18 |
0.006 |
| 9503 |
6.20 |
0.48 |
0.030 |
| 9504 |
6.89 |
0.33 |
0.022 |
| 9505 |
2.86 |
0.42 |
0.120 |
6 讨论
我们建立了用HPLC反相柱从石杉总碱中直接测定石杉碱甲的方法，该方法线性与精密度良好，平均回收率为99.89%,平均RSD为
0.40% 。用此方法测定了5批石杉总碱样品，重复性好。该数据的可靠性，在生产石杉碱甲的工作中得到了证实。
从石杉碱甲原植物中提取总生物碱，是一个常规和稳定的方法。通过测定总碱中石杉碱甲的含量，便可以推算出原植物中石杉碱甲的含量。该方法已经成为检定原植物的方法并应用于工作中。
［作者简介］杨明(1958-)，男，河北秦皇岛人，实验师，硕士。
杨明(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
姚志伟(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
赵毅民(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
栾新慧(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
参考文献
［1］徐择邻,储宾孟,栾新慧.福定碱的结构测定［J］.解放军医学杂志 1985；10：263.
［2］王月娥.石杉碱甲的抗胆碱酯酶的作用［J］.中国药理学报 1986；7（17）：110.
［3］程源深,吕传真,应智林.石杉碱甲治疗重症肌无力症候28例［J］.新药与临床 1986；5(4)：197.
军事医学科学院院刊2000年第24卷第3期
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