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近年来，受体药理学研究表明，细胞膜上的药物受体能选择性地识别药物并与之结合，并通过影响细胞内第二或第三信使分子导致一定的生物效应，最终产生药理作用［1］. 具有这种作用机制的药物，在研究过程中有两个重要的环节：第一，药物与膜及膜受体的相互作用；第二，受体本身的启动、变构和信息传导. 这两个环节密切相关，前一环节是后一环节的必要条件，显示出研究药物与膜受体作用的重要性.
1965年Paton和Rang［2］首先将放射性配体结合试验(radioligand binding assay, RBA）用于药物与受体作用研究. 在RBA法中，受体制剂一般为完整细胞悬液、细胞组分和受体蛋白，而放射性配体则需要由专门的实验室合成，实验条件不易控制并易造成同位素污染，使该方法的应用受到一定的限制.
将活性细胞膜固定在某种载体表面，形成载体细胞膜(carrier cell membrane, CCM),最大限度地保持了细胞膜的整体性、膜受体的立体结构、周围环境和酶活性，具备普通细胞膜制剂的特性. 同时，硅胶CCM还具有一定的刚性，有可能作为一种生物活性填料用于液相色谱, 形成一种能模仿药物与靶体相互作用的色谱系统. 在这种色谱系统中，药物与细胞膜及膜受体间疏水性、电荷、氢键和立体等作用，就能用色谱的各种表征参数定量表征. 从而有可能建立一种研究药物作用机理和药物筛选的新的色谱方法.
1 实验
(ⅰ) 试药与材料. 盐酸维拉帕米(±verapamil hydrochloride, VP)，盐酸地尔硫(diltiazem hydrochloride, DT)，(±)Bay-K8644，(＋)Bay-K8644和(-)Bay-K8644, 尼莫地平(nimodipine, NM)，尼群地平(nitrendipine, NT)，尼瓜地平(niguldipine, NG)为RBI公司产品；尼卡地平(nicardipine, NC)和硝苯地平(nifedipine，NF)为Sigma公司产品；三磷酸腺苷(ATP) 及其他试剂均为分析纯，必要时进一步纯化. 健康家兔，雌雄不限，由西安医科大学实验动物中心提供；大孔球形硅胶(粒度7 μm，孔径100 nm)，购自中国科学院化学研究所.
(ⅱ) 细胞膜制备. 兔红细胞膜、心肌细胞膜和小脑细胞膜的制备参照文献［3］方法进行，并用电子显微镜技术对细胞膜纯度及膜结构进行了鉴定，观察到了细胞质膜的片状物及由膜性结构卷曲成的小泡，说明细胞膜的制备方法可行. 细胞膜悬浮于一定体积的50 mmol·L-1 Tris HCl(pH=7.4)缓冲溶液中，制成悬液细胞膜，用Lowry法［4］测定膜蛋白含量，一般不低于0.5 mg·mL-1.
(ⅲ) 硅胶CCM的制备. 取经表面活化处理的硅胶于低温（4℃)反应管中，加入悬液细胞膜，直至吸附反应达到平衡. 向反应管中补加等体积的去离子水，使细胞膜的磷脂双层进行自身相互作用，直至在硅胶表面形成均匀的细胞膜. 离心除去上清液，硅胶CCM用Tris-HCl缓冲溶液洗涤，除去未结合的细胞膜.
(ⅳ) 色谱条件. 分别将硅胶载体和硅胶CCM固定相，用低压湿法装入不锈钢色谱柱(50 mm×2 mm(ID))或 200 mm×2 mm (ID))中，在流速为0.3～0.5 mL·min-１，检测波长236 nm，柱温37℃条件下，用流动相(流动相Ⅰ: 50 mmol·L-１磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)；或流动相Ⅱ: 50 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液(pH=7.4)，其中含有150 mmol·L-１ NaCl和1 mmol·L-１ CaCl2)平衡约2 h后，开始进样分析.
2 讨论
2.1 硅胶CCM的表面特征
在水溶液中，硅胶表面上的硅羟基对生物大分子的吸附性极强，通常认为是不可逆的.硅胶表面的硅羟基会与膜蛋白和脂类分子中的极性基团作用，使细胞膜牢固地吸附(固定)在硅胶的表面. 另外，细胞膜具有磷脂双层结构的特性,脂质分子极性头间的离子相互作用,膜内部烷基链间的疏水相互作用,使吸附在硅胶表面的细胞膜碎片间彼此靠近而融合,并自动形成闭合结构,结果硅胶表面完全被细胞膜覆盖. 而通常用的化学键合方法则由于空间效应, 根本无法实现对硅胶表面硅羟基的完全覆盖［5］.
为证实上述观点，用电子显微镜技术和表面能谱技术对硅胶CCM表面进行了测试. 图1为用电子显微镜放大6 000倍后观察到的硅胶载体(图1(a))和硅胶CCM(图1(b))电子显微镜图像. 可见,硅胶CCM中细胞膜已完全覆盖在硅胶表面并与硅胶连为一体,与纯硅胶载体明显不同. 图1(c)是在电子显微镜下放大1 500倍的硅胶CCM电子显微镜图像，可以看出，载体硅胶表面被细胞膜有效地覆盖后,由于单一硅胶CCM颗粒表面细胞膜间的相互作用使多个硅胶CCM呈堆积状. 图2为硅胶载体(图2(a))与硅胶CCM(图2(b))的全表面能谱分析图. 从图2(a)看出，在0.52 kV处有氧(O)的能谱峰，1.74 kV处有较强的硅(Si)能谱峰；从图2(b)看出，在0.27 kV处增加了碳(C)的能谱峰，0.52 kV处氧(O)的能谱峰强度有所增加，而1.74 kV处的硅(Si)峰几乎消失. 在2.05 kV处的铂(Pt)峰为生物样品制片时喷涂的铂金. 这进一步证实了硅胶CCM中硅胶表面的硅羟基已完全被细胞膜所覆盖.
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图1 硅胶载体和硅胶载体细胞膜扫描电镜图像 (a) 硅胶载体(放大6 000倍)；(b) 硅胶载体细胞膜 |
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图2 硅胶载体和载体细胞固定相能谱表面分析图 (a)硅胶载体；(b) 硅胶载体细胞膜 |
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