HPLC测定血浆中厄贝沙坦含量

摘  要  18名健康志愿者随机交叉单剂量口服厄贝沙坦胶囊和厄贝沙坦片剂300mg，进行药代动力学和相对生物利用度研究。血药浓度采用高效液相色谱法测定。结果表明：胶囊和片剂的主要药代动力学参数Cmax分别为2.51±0.66和2.46±0.46 mg·L-1，Tmax分别为1.50±0.70和1.29±0.47 h，T1/2分别为10.28±4.48和10.13±5.42 h，AUC0-24分别为9.99±2.24和10.21±1.84 mg·h·L-1。相对生物利用度为98.13± 12.52%，结果显示胶囊和片剂生物等效。

关键词  厄贝沙坦；生物利用度


    厄贝沙坦（irbesartan）是继氯沙坦以后的又一种新型血管紧张肽Ⅱ（ATⅡ）受体阻断剂，它通过对血管紧张肽Ⅱ受体1的抑制作用，抑制ATⅡ所引起的血管收缩和血压升高作用。厄贝沙坦在高血压、充血性心力衰竭等的治疗中发挥重要作用，具有降压作用显著、副作用小等优点。
本实验的目的是建立厄贝沙坦的体内高效液相色谱测定方法，比较胶囊和片剂在健康男性成人体内的药代动力学过程，评价厄贝沙坦胶囊的相对生物利用度，为厄贝沙坦胶囊制定合理的临床给药方案提供依据。
                           材 料 和 方 法
1.药品
    试验药品：厄贝沙坦胶囊，合肥医工医药研究所研制，批号：991103，规格：含厄贝沙坦75mg/粒。
    对照药品：厄贝沙坦片，南京长奥制药有限公司产品，批号：991025，规格：含厄贝沙坦75mg/片。
2.仪器
    Waters 高效液相色谱仪，包括Waters 515泵；Waters 717plus自动进样器；Waters柱温箱及温控器；PE LC-240荧光检测器；Waters Millennium32色谱数据处理软件。
3.试剂
    乙腈（美国TEDIA公司）为HPLC级，磷酸（南京化学试剂一厂）、三乙胺（上海化学试剂公司）、甲醇（南京化学试剂厂）均为分析纯，水为自制双蒸水。
4.血浆中厄贝沙坦测定方法
4.1 色谱条件
    色谱柱：Hypersil BDS C18 200´4.0mm，5um（大连依利特科学仪器有限公司），柱温：30℃；提取用小柱：Sep-Pak Vac(100mg) CN Cartridges，Waters公司；流动相：乙腈：水：三乙胺（50：40：0.2），用磷酸调pH至3.5；荧光激发波长250 nm，发射波长371nm。
4.2 样品处理
    先以2ml甲醇活化小柱，再以2ml 1%磷酸冲洗，将0.5ml血浆、0.5ml 1%磷酸、40ul内标溶液充分混合后上样，待混合液通过小柱后，以3ml 1%磷酸冲洗，再以1 ml洗脱液洗脱，收集洗脱液放入自动进样器，进样50ml分析。
4.3 标准曲线测定
    0.5ml空白血浆中加入适量不同浓度的厄贝沙坦溶液，使血浆药物浓度为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0mg/ml，加入内标后涡旋混匀10s，用小柱提取后收集洗脱液进样分析，记录厄贝沙坦和内标峰面积，算出比值F。以浓度（C）对比值（F）作加权直线回归计算（权重因子为K/F，K=10.3118），得回归方程为：C＝0.4792×F+1.102´10-4，（r=0.9996，n=5）。血浆中厄贝沙坦最低可检出浓度为0.01mg/ml。
4.4 精密度
    0.5ml空白血浆中加入适量不同浓度厄贝沙坦溶液，使血浆药物浓度为0.05、0.5和5.0mg/ml，加入内标后涡旋混匀10s，用小柱提取后收集洗脱液进样分析，记录厄贝沙坦峰面积和内标峰面积比F，算出相应浓度。测定日内变异和五天内的日间变异，结果见表1。

4.5 回收率
    0.5ml空白血浆中加入适量不同浓度厄贝沙坦溶液，使血浆药物浓度为0.05、0.5和5.0mg/ml，加入内标后涡旋混匀10s，用小柱提取后收集洗脱液进样分析，记录厄贝沙坦峰面积和内标峰面积比F1；另取1ml塑料离心管数个，加入适量不同浓度厄贝沙坦溶液和内标，加入1ml洗脱液稀释后进样分析，记录厄贝沙坦峰面积和内标峰面积比F2。按（F1/F2）´100%计算回收率，回收率均大于90%。按峰面积比较内标的回收率也大于90%。

5.实验设计
5.1 受试者
    18名健康志愿者为受试者，体重61.14±6.63Kg，年龄23.5±0.9岁。受试者均无肝、肾疾病史及药物过敏史，精神状态良好，全面体格检查均正常（其中包括肺部听诊、肝脾触诊、心电图、心率、血压、肾功能、肝功能、血常规及尿常规等）。受试者在受试前两周内未服过任何药物，从开始进入试验后直至试验结束，不吸烟、不食用任何含醇食物。18名受试者在被告知所有与药物有关可能的不良反应后，签署知情同意书。
5.2 试验方法
    18名受试者根据体重配对，随机分组（每组9人），一组先口服供试制剂(T)，后口服标准参比制剂(R)，即TOR；另一组先口服参比制剂，后口服供试制剂，即ROT。禁食12h后，8:00 am空腹用温开水200ml送服给药300mg，服药后2h后自由进水，服药后4h统一进食。在给药前及给药后0.25，0.50，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8，10，12，24，36小时取静脉血2 ml。经肝素抗凝，低温离心分取血浆，将血浆于-20℃冰箱中保存备用。两种制剂间隔1周。
6.数据分析处理
    使用3P97软件计算药代动力学参数，用梯形法计算AUC，达峰时间（Tmax）和达峰浓度（Cmax）为实测值。通过交叉试验设计的方差分析和双向单侧T检验来分析两种制剂的主要药代动力学参数，并对生物等效性进行评价。
                        结  果
1.色谱行为
    图1为空白血浆，空白血浆加入标准品，受试者服药后的色谱图。由图可见，厄贝沙坦、内标与血浆中其他杂质峰分离良好，厄贝沙坦保留时间为5.5min，内标保留时间为7.6min。

2.药代动力学研究
    18名健康受试者交叉给予胶囊和片剂后血浓-时间曲线见图2。

    根据厄贝沙坦血浆浓度-时间数据估算出药代动力学参数，主要药代动力学参数见表2。
    结果表明，厄贝沙坦胶囊和片剂的达峰血药浓度分别是2.51±0.66 mg·L-1和2.46±0.64 mg·L-1，达峰时间分别是1.50±0.70 h和1.29±0.47 h，消除半衰期分别是10.28±4.48 h和10.13±5.42 h，0～24 h的药时曲线下面积分别是9.99±2.24 mg·h·L-1和10.21±1.84 mg·h·L-1。主要药代动力学参数经Willcoxon检验无显著性差异。

3.厄贝沙坦胶囊的相对生物利用度
    受试者交叉服用厄贝沙坦胶囊和片剂后，用血药浓度-时间曲线下面积（AUC0-24）计算各自生物利用度，羧甲司坦泡腾片的相对生物利用度平均为98.13± 12.52%。
4.统计分析
    两种制剂的lnAUC0-24、lnCmax采用双单侧t检验，lnAUC0-24的t1=6.045、t2=7.743，lnCmax的t1=5.014、t2=3.809。结果显示t1、t2均大于t(1-0.05)=1.746，故两种制剂具有生物等效性。
                           讨  论
    我们参考有关文献[1]建立了血浆中厄贝沙坦的测定方法，使用固相小柱来提取血浆中药物。由于厄贝沙坦的pKa大约是4.5，为了保证结果稳定，在上样之前，必须用稀磷酸冲洗酸化小柱，以抑制厄贝沙坦离子化。我们还考察了C18和C8填料的小柱，发现厄贝沙坦在这两种填料上保留强于CN填料，需用更强的洗脱液来洗脱才能保证回收率，而且，使用更强的洗脱液也会引入更多的杂质，所以我们选用CN填料小柱。


                       参 考 文 献